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1、酵母细胞的固定化,一、基础知识,1、酶制剂的概念和种类,（一）酶制剂,含有酶的制品,定义：,多酶片、加酶洗衣粉中的蛋白酶和脂肪酶,种类：,A、液体酶制剂,治疗某些胃病的胃蛋白酶液,B、固体酶制剂,2、酶的生产,提取法,定义：采用一定的技术直接从动植物或微生物的组织、细胞中将酶提取出来,优点：,简单易行，在动植物或微生物资源丰富的地区具有应用价值,实例：在屠宰厂，可以从家畜胰脏中提取出胰酶；在水果加工厂，可以从菠萝皮中提取出菠萝蛋白酶,缺点：,要有充足的原材料，广泛应用受到限制,发酵法,定义：通过微生物发酵获得所需要的酶,如果是胞外酶，可以从发酵液中直接提取；如果是细胞内酶，则可将细胞弄碎再经过
2、提取纯化而得到,易培养、繁殖速度快、便于大规模生产,优点：,提取方式：,化学合成法,缺点：,成本高、已知分子结构的酶,提取出来的酶还要经过分离、纯化，再加入适量的稳定剂和填充剂，制成相应的酶制剂后才能用于催化化学反应,3、酶的提取和分离纯化,酶的提取,盐溶液提取法碱溶液提取法、有机溶剂提取法,适宜的温度和pH和保护剂,方法：,条件：,酶的分离提纯,沉淀技术（密度梯度离心法）,层析技术,方法：,4、酶制剂特点,天然酶通常对强酸、强碱、高温和有机溶剂等条件非常敏感，容易失活,溶液中酶很难回收，不能再次利用，提高了生产成本,反应后，酶会混在产物中，影响产品质量，难以在工业生产中广泛应用,（二）固定化
3、酶,固定化酶是指限制或固定于特定空间位置的酶，具体来说，是指经物理或化学方法处理，使酶变成不易随水流失即运动受到限制，而又能发挥催化作用的酶制剂,（三）固定化细胞,将细胞限制或定位于特定空间位置的方法称为细胞固定化技术,被限制或定位于特定空间位置的细胞称为固定化细胞,固定化技术：,固定化细胞：,（四）直接使用酶、固定化酶和固定化细胞催化的优缺点,（五）酶和细胞固定化方法,1、物理吸附法：,将酶吸附到固体吸附剂表面的方法，固体吸附剂多为活性碳、多孔玻璃等,2、包埋法,定义：将酶包裹在多孔的载体中，包埋成格子型或包埋成微胶囊型,载体：明胶、琼脂糖、海藻酸钠、醋酸纤维素和聚丙烯酰胺,种类,凝胶包埋法
4、：将个别酶分子包在高聚物格子中，可以将块状聚合形成的凝胶切成小块，也可以直接包埋在珠状聚合物中，这样作可以使固定化酶机械强度提高10倍，并改进酶脱落的情况,微囊化法：将酶溶液或悬浮液包裹在膜内，膜既可以使酶存在于类似细胞内的环境中，又阻止酶的脱落或直接与微囊外环境接触。小分子底物能迅速通过膜与酶作用，产物也能扩散出来,交联法：通过双功能试剂，将酶和酶联结成网状结构的方法,3、化学结合法：,定义：将酶分子相互结合，或将其结合到纤维素、琼脂糖，离子交换树脂等载体上的固定方式,种类,共价结合法：酶和载体以共价键的形式结合在一起的方法，这种方法需要酶和载体都具有氨基、羧基或羟基等官能团,（六）酶和细胞
5、固定方法的选择,酶适合采用化学结合和物理吸附法固定,细胞适合采用包埋法固定,1、方法,2、原因,细胞个大，酶分子很小,个体大的细胞难以被吸附或结合而个小的酶容易从包埋的材料中漏出,（七）固定化酶的应用实例,1、高果糖浆,生产原料,葡萄糖，葡萄糖是由淀粉转化而来,是以酶法糖化淀粉所得的糖化液，经葡萄糖异构酶的异构作用，将其中一部分葡萄糖异构成果糖，由葡萄糖和果糖而组成的一种混合糖糖浆,生产机理,生产流程,2、固定化酶技术生产高果糖浆,使用固定化酶技术，将葡萄糖异构酶固定在一种颗粒状的载体上，再将这些酶颗粒装到一个反应柱内，柱子底端装上分布着许多小孔的筛板。酶颗粒无法通过筛板上的小孔，而反应液却可
6、以自由出入。生产过程中，将葡萄糖溶液从反应柱的上端注入，使葡萄糖溶液流过反应柱，与固定化葡萄糖异构酶接触转化成果糖，从反应柱的下端流出,生产过程,生产优点,反应柱能连续使用半年，大大降低了生产成本，提高了果糖的产量和质量,二、实验操作,（一）方法,1、包埋法固定化细胞,2、海藻酸钠作载体包埋酵母细胞,（二）制备固定化酵母细胞,1、酵母细胞的活化,过程,称取1g干酵母，放入50ml的小烧杯中，加入蒸馏水10ml。用玻璃棒搅拌，使酵母细胞混合均匀，成糊状，放置1h左右，使其活化,注意事项,A、选用的干酵母要具有较强的活性，而且物种单一,B、在缺水状态下，微生物处于休眠状态。活化就是让处于()的微生
7、物重新恢复正常的生活状态,休眠状态,2、配置物质的量浓度为0.05mol/L的CaCl2溶液,过程,称取无水CaCl2 0.83g，放入200ml的烧杯中，加入150ml的蒸馏水，使其充分溶解，待用,注意事项,溶解物质要彻底，勿用自来水溶解，以防自来水中各种离子影响实验结果,3、配制海藻酸钠溶液,称取0.7g海藻酸钠，放入50ml小烧杯中，加入10ml水，用酒精灯加热，边加热边搅拌，将海藻酸钠调成糊状，直至完全溶化，用蒸馏水定容至10ml,过程,注意事项,加热时要用()，或者()，反复几次，直到海藻酸钠溶化为止,小火,间断加热,海藻酸钠的浓度涉及到固定化细胞的质量。如果海藻酸钠浓度过高，将很难
8、形成凝胶珠；如果浓度过低，形成的凝胶珠所包埋的酵母细胞的数目少,4、海藻酸钠溶液和酵母细胞混合,将溶化好的海藻酸钠溶液冷却至室温，加入以活化的酵母细胞，进行充分搅拌，再转移至注射器中,过程,注意事项,A、溶化好的海藻酸钠溶液必须冷却至室温，否则会因温度过高杀死酵母菌,B、搅拌要彻底充分，使两者混合均匀，以免影响实验结果的观察,（5）固定化酵母细胞,以恒定的速度缓慢的将注射器中的溶液滴加到配制好的CaCl2溶液中，将形成的凝胶珠在CaCl2溶液中浸泡30min左右,过程,注意事项,A、可利用海藻酸钠制成不含酵母菌的凝胶珠，用作对照,B、海藻酸钠胶体在CaCl2这种电解质的作用下，发生聚沉，形成凝
9、胶珠，需稳定30min左右,（三）用固定化酵母细胞发酵,将固定化酵母细胞（凝胶珠）用蒸馏水冲洗23次，洗去凝胶珠表面多余的电解质溶液,1、过程,刚形成的凝胶珠应在CaCl2溶液中浸泡一段时间，以便形成稳定的结构。检验凝胶珠的质量是否合格，可以使用下列方法。一是用镊子夹起一个凝胶珠放在实验桌上用手挤压，如果凝胶珠不容易破裂，没有液体流出，就表明凝胶珠的制作成功。二是在实验桌上用力摔打凝胶珠，如果凝胶珠很容易弹起，也能表明制备的凝胶珠是成功的,将150ml质量分数为10的葡萄糖溶液转移至200ml的锥形瓶中，再加入固定好的酵母细胞，置于25C下发酵24h,2、注意事项,控制好发酵温度，一般是室温25 C,发酵时间可视具体情况而定，一般时间稍长一些，效果明显,可用不含酵母的凝胶珠做相同的处理，对照实验结果,（一）观察凝胶珠的颜色和形状如果制作的凝胶珠颜色过浅、呈白色，说明海藻酸钠的浓度偏低，固定的酵母细胞数目较少；如果形成的凝胶珠不是圆形或椭圆形，则说明海藻酸钠的浓度偏高，制作失败，需要再作尝试。（二）观察发酵的葡萄糖溶液利用固定的酵母细胞发酵产生酒精，可以看到产生了很多气泡，同时会闻到酒味,课题成果评价,
