《暨南大学动物细胞工程.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《暨南大学动物细胞工程.docx（15页珍藏版）》请在三一办公上搜索。
1、动物细胞工程(gongcheng)第一章概念(gdinidn)：动物细胞工程(gongcheng)：是指以动物细胞、细胞器或早期胚胎为研究对象，应用细胞生物学和分子生 物学原理和方法，对其进行培养、繁殖、人工操作等，使其产生人们所需的生物学特征，获得人类所需 的生物产品、创造新的细胞类型(fixing )或动物品种的一门综合科学。生物工程：人们运用现代生物科学、工程学和其他基础学科的知识，按照预先的设计，对生物进行控制 和改造或模拟生物及其功能，用来发展商业性加工、产品生产和社会服务的新兴技术领域动物细胞工程包含哪些内容动物细胞培养技术干细胞工程动物细胞融合单克隆抗体制备染色体工程基因打靶与转
2、基因动物生殖细胞工程胚胎工程第二章概念：细胞培养：是指细胞在体外条件下的生长，在细胞培养的过程中，细胞不再形成组织组织培养：是指组织在体外条件下的保存或生长，此时可能有组织分化并保持组织的结构或功能原代培养:以直接取自生物体细胞.组织或器官开始的培养传代培养：无论是否稀释，将细胞从一个培养瓶转移或移植到另一个培养瓶即称为传代或传代培养细胞系：原代培养物经首次传代成功后即成为细胞系细胞虹通过选择法或克隆法形成从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质或标志的培养称为细胞株，从培养代数来讲,可培养到40-50代以上细胞培养实验室必须的设备有哪些？1. 无菌实验室 实验准备室培养体系配制室培养室观察室
3、2. 净化台适用于照菌操作、鲍织培养之用3. 培养箱和CO2培养箱 用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。保持培养箱内空气干净。定期消毒(90 C，14 h)。 箱内火菌蒸馏水3000毫升蒸馏水槽中以保持箱内湿度，避兔培养液蒸发。4. 倒置显微镜5. 液氮罐盛装一196C的液氮，用来冻存细胞6. 器材的清洗与消毒7. 灭菌、消毒器具 紫外线直接照射法干热湿热消毒滤过消毒消毒剂煮沸消毒动物细胞体外培养必要的条件有哪些？为无菌、生长环境(PH值、温度)和营养1) 温度 细胞对低温的耐受性要比对高温的耐受性强些，低温下会使细胞生长代谢速率降低；一经恢复正常温度时， 细胞会再行生长。若在40
4、C左右，则在几小时内细胞便会死亡。因此高温对细的威胁甚大。2) 气体 细胞的生长代谢自然离不开气体，容器空间中的02及CO2足以保证细胞体内的代谢活动的进行，但作为代谢 产物的C02在培养环境中还有另外一个重要作用，即调节PH的作用。3) PH值 细胞培养的PH最适为7.2 7.4间，当PH低于6.0或高于7.6时，细胞的生长会受到影响，甚至导致死 亡。但是，多数类型的细胞对偏酸性(suan xing)的耐受性较强，而在偏碱性的情况下则会很快死亡。4）营养在保证细胞渗透压的情况下，培养液里的成分要满足细胞进行糖代谢、脂代谢、蛋白质代谢及核酸代谢所需要 （xuyao）的各种组成，如包括十几种必需
5、氨基酸及其它多种非必需氨基酸、维生素、碳水化合物及无机盐类等。传代培养和原代培养的实验过程（gudchdng）（原代培养没找到呀呀）细胞的冻存与复苏（句su）的过程，细胞冻存液 细胞的冻存和复苏的原则“缓冻速融”冻存：1显微镜下观察培养细胞2制备细胞悬液（同贴壁细胞传代）3细胞悬液转入15mL离心管中，离心1200rpm 5min4去上清5加入细胞冻存液（培养基中含10% DMSO （二甲亚砜），20-50%小牛血清）6放置室温冻存盒中，封闭严实7置-80 C冰箱过夜8转入液氮中（一196C ）复苏：1从液氮中取出冷冻管（如为安瓶或无螺帽冷冻管，应防突然爆裂而伤皮肤和眼睛）2立即放入37C水浴
6、中，振荡，使之尽快融化（12分钟），如不是螺旋盖冷冻管，则要用镊子夹住冷 冻管，防止水进入而造成污染。3将细胞悬液转入10 mL预热的培养液中，混悬，离心洗涤，1200rpm，5min。4去上清，加入培养液，调细胞浓度为12X105 /mL5转入细胞培养瓶中培养细胞培养过程中的主要污染类型有哪些？如何预防和防治污染？污染类型：细菌、真菌、病毒或细胞均可导致培养物污染。生物的组织材料、操作者自身、培养基、各 种器皿、甚至环境均可引起污染。预防和防治：显著污染的标志是培养基pH值的迅速改变、细胞外形模糊、甚至出现漂浮的集落。1）组织出现污染，可加青霉素200U/mL、链霉素200U/mL、和制霉素
7、100U/mL。2）卡那霉素（100U/mL）是支原体药物，可抑制其感染，但不能根除。对实验室工作者说来更严重的一种污染乃是其他细胞的交叉污染。3）在任何时间，在一个工作区中决不能有一种以上的细胞系的细胞同时存在。4）一种细胞系的细胞所用的培养基、器皿、移液管等决不能为另一种细胞系的细胞所移用。5）一旦在同质的细胞群中出现不同形态的集落，则应怀疑是否发生了细胞污染，应用染色体组型及同功酶组型鉴定。细胞传代培养实验（shiydn）过程有那些？应该注意些什么问题？细胞生长曲线分哪些（ndxi。）时期游离（y6uH）期 细胞接种后在培养液中呈悬浮状态.也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。贴壁期
8、 细胞附着于底物（di wu）上，游离期结束。细胞株平均在10分钟一4小时贴壁。潜伏期 此时细胞有生长活动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一般为624小时。对数生长期 细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。 停止期（平台期）细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂。细胞大规模培养的类型有哪些？各有什么特点？1）悬浮培养法（微载体培养法）优点：能大大提高细胞的生长效率和产量，节省人力物力、时间空间等优点，为细胞工程的发展与应用研究提供有 利的条件2）灌注系统培养法优点：搅拌使所有细胞与营养液和气体充分接触，有利于细胞生长； 培养条件更接近稳定状态； 连续加液使细胞系长期持续对数生长。
9、3）中空纤维细胞培养法优点：由于血清含量少，其抗体纯度比腹水mAc的高两倍。生产成本低。4）微包夹法优点：5）子宫内种植法6）牛淋巴液循环法优点：淋巴液是高质量的营养液，可提高单位体积内细胞密度 成本低 能稳定地获得营养和处理废物，利于细胞生长 是一种连续的密闭系统，可减少污染 易在微机处理，控制下实现自动化培养细胞的主要鉴定方法有哪些？1、荧光抗体染色鉴别细胞的种属间接荧光抗体染色技术一采用兔产生的特异性抗血清标记待测细胞和阳性细胞、阴性细胞。加标记有荧光染料 （FITC）的山羊抗兔疫球蛋白抗体。后加上的荧光抗体将结合到已标记有兔抗体的靶细胞上，借助荧光即可看到抗 原一抗体复合物。2、同工酶
10、谱系鉴别细胞种属通过确定三种同工酶系统6-磷酸葡萄糖脱氢酶（G6PD）乳酸脱氢酶（LDH）核苷磷酸化酶（NP）垂直淀粉胶电 泳的迁移率，可以鉴定细胞系的种属来源。该法有高度的可靠性，简单、重复性好。3、染色体分析多数情况下，即使普通显微镜观察技术，足以鉴定不同种的染色体结构的差异。图染色体核型分析足以鉴定不同 种间细胞系之间的污染。第三章概念：细胞融合：是指两个或两个以上的相同或不同的细胞合并形成一个细胞的过程。克隆：又称“无性繁殖系”。遗传组成完全相同的分子、细胞或个体及其组成的一个群体克隆化：经过人为选择，获得在遗传上纯一的后代的技术或过程。饲养细胞：铺在培养器皿上的经过处理不分裂的细胞。
11、可为体外培养细胞提供生长因子或细胞因子HAT培养基：当细胞融合之后要加HAT培养液，这种培养液是在普通培养基里面加上HATH为次黄嘌吟HypoxantbhineA为氨基喋吟AminopterinT为胸腺嘧啶Thymidine）。使脾细胞及骨髓瘤细 胞不能繁殖而死亡，但融合的杂交瘤细胞可以大量地繁殖，属选择性培养基。细胞融合的方法（fangfd）有哪些？1. 病毒（bingdd ）融合剂：最早被采用（caiyong）病毒融合剂有疱疹病毒、天花病毒和副粘液病毒等在内的病毒类融合剂。灭活仙台病毒介导细胞融合过程可以大大提高融合频率。它在病毒类融合剂中最为有效，使用（shiyO ng）最广。这种病毒可
12、进入细胞内，在邻近的细胞之间形成细胞质桥2. 化学融合剂（PEG）1. PEG可能使细胞膜（尤其是有丝分裂的骨髓瘤细胞）的脂类分子的物理结构发生重排，容易被PEG 作用打开细胞膜，使细胞融合。2. PEG可能把细胞膜上的蛋白质分子排开，使脂质体扦入与膜结合。3. PEG可能作用于膜磷脂极性基团和细胞膜表面蛋白。使膜磷脂的表面电位下降，同时使膜糖蛋白的 排阻体积减少，最终使膜出现缺口，进而融合。3、电融合技术悬于大小不同的两平行电极间的低导电率溶液中的细胞，在1-100MHz和100-1000V/cm的交流电场 中，会向小电极移动，并极化成偶极子，而沿电场方向排列成串，此时再加上适当强度和持续时
13、间的高 压电脉冲、即可使相邻细胞膜的接触区产生可逆电击穿，从而触发细胞融合。4、激光融合5、空间微重力融合利用空间微重力条件进行细胞融合实验的目的，是利用在微重力条件下细胞在融合液中重力沉降现 象消失，可以提高电融合杂种细胞得率和细胞活力，为人类利用微重力资源进行空间制药探索的新方 法。如“神舟四号”上的实验成功。融合细胞的克隆化的方法有那些？细胞克隆化培养的过程如何，有哪些注意事项，细胞克隆化融合细胞的克隆化的方法及过程按其分离单细胞的方法不同，大致可分为1）有限稀释法有限稀释法原理是从理论上将细胞稀释到10个/ml，然后装成每小孔（96孔板）0.1ml，使每孔理论上含 有单个细胞，经过培养
14、后即可获得单个细胞形成集落。2）软琼脂培养法本法对于某些抗原，可以把克隆化培养与特异性筛选测定结合起来进行，所以它的特点是效率较高，速 度较快。但缺点是克隆率不高。基本原理：利用单个细胞在软琼脂培养基上的局限化生长，待细胞集落长到肉眼可见后，用巴氏吸管从琼脂上挑出 来（一般810天后），再移到液体培养基中，进行生长繁殖，并检测培养上清液的活性。也可以用溶血 空斑技术或围绕集落形成免疫沉淀的方法来直接测它的活性。3）显微操作法在倒置（或解剖）显微镜下，借助于毛细吸管将单个细胞个别吸出，分别放入已加饲养细胞的96孔培养孔 内，根据原理不同，又分为普通法和玫瑰花结两种方法。?普通显修镜操作法于6皿寺
15、平皿中，愤如的10,个折陷，养威箱中】小时左右无菌命件，在倒克按锐下去平皿JLI用直寿档去南管9毋由率个航感移4,强先加南辆弄细胞的95孔板内直至95孔均务装疳*把，加于CO华弄箱内培养 Q现察与更榛培养方;fe河看根稀释法玫瑰花结：原理：分泌抗体细胞在其表面含有抗原受体，在一定的条件下常可与特异性抗原致敏的羊红细胞形成玫 瑰花结。如果从免疫动物的脾细胞中除去能形成特异性玫瑰花结的细胞则失去（shiqh）对特异性抗原的反 应性。1 岬L个杂衰瘤ittjfe*!%fitMWSRBC KOnLI在壶械蛾下可北政旅花帖舟成抽胞I就心I花格蛆鹿入96孔极膝彝ELISA签定4) 盖片分离法用打锤于洁净株
16、胶上砸干净盖片选择碎块.大小形态适用的选出加培养波及进行嫡胞培养倒置镜下选初胞，挑由单玺胞放片a进有单个细感培养5) 荧光激活(ji hu6)细胞分离器法用本仪器分离单细胞的原理(yudnli)是将悬液中的细胞引入一种液流的中央，使其一个接一个地通过聚 焦的高能激光束，根据荧光和光放射的性质快速分析和分离细胞。该仪器(yiqi)的主要功能：1) 利用荧光对代测细胞的光散射程度测定细胞大小2) 应用已知的McAb与代测细胞或已知细胞与未知McAb结合后。加荧光素标记的荧光抗体，按细胞结合 的荧光素量的差别区分。3) 利用制备型FACS还可分离单细胞。纯度可达90-99%注意事项： 待克隆细胞生长
17、处于对数增长期； 小牛血清的质量和浓度； 细胞计数要准确； 及时观察细胞生长情况。培养的应用在那些方面。1. 疫苗：口蹄疫疫苗乙型肝炎疫苗等2. 干扰素：a和B干扰素3. 单克隆抗体4. 基因重组产品：免疫球蛋白G、A和M、尿激素等第四章概念：淋巴细胞杂交瘤，单克隆抗体淋巴细胞杂交瘤(Hybridoma):即利用细胞杂交技术将致敏的淋巴细胞(T或B细胞)与相应的细胞(胸腺瘤 或骨髓瘤)进行融合而产生的杂种细胞。(包括可产生抗体的B淋巴细胞杂交瘤和可产生淋巴因子或发挥 某类T细胞功能的T淋巴细胞杂交瘤。)它的目的主要是为获得淋巴因子或单克隆抗体。单克隆抗体：由一个B细胞克隆产生的,可识别一种抗原
18、表位的同源抗体。单克隆抗体的制备程序有哪些？ B淋巴细胞杂交瘤技术操作全过程单克隆抗体的制备(zhibei)过程：1. 选择(xudnzQ)骨髓瘤细胞2. 选择免疫(midnyi)动物3. HAT培养液4. 细胞融合剂5. B淋巴细胞杂交瘤的种类（zhbngl，）B淋巴细胞杂交瘤技术操作全过程1. 选择骨髓瘤细胞理想的杂交瘤细胞系具有下列特征： 能在体外连续生长，倍增期短于24小时； 缺乏HGPRT酶； 克隆效应高； 在动物中有致肿瘤性； 与小鼠淋巴细胞融合率相当高； 本身不合成Ig,且不抑制杂交瘤细胞中的Ig合成基因。从理论上选用不合成自身免疫球蛋白轻、重链或仅有免疫球蛋白的轻链的骨髓瘤细胞
19、作为亲本细胞与 脾细胞融合是最为理想的。不论哪种细胞，选择对数增殖期的细胞用于融合，是融合成功的最重要因 素。2. 选择免疫动物选择免疫动物，即供脾动物，通常选用小鼠。正常供体和骨髓瘤细胞种系发生越近缘，产生的杂交瘤就 越稳定（反之亦然）。3. HAT培养液HAT培养液是在普通培养基里面加上HAT （H为次黄嘌吟Hypoxantbhine，A为氨基喋吟Aminopterin，T为胸腺嘧啶Thymidine），使脾细胞及骨髓瘤细胞不能繁殖而死亡，但融 合的杂交瘤细胞可以大量地繁殖，属选择性培养基。4. 细胞融合剂PEG分子量和浓度越大，其融合率越高，但它的细胞毒性和粘度也随之增大。一般认为PEC
20、浓度为30 50%时，以分子量1000的融合效果最佳。如果浓度增至50%和60%时则改 变PEG400为好。以PEG处理细胞1 2分钟，而后通过立刻离心或加液稀释，以及时终止PEG的作用。单克隆抗体的有哪些特性？单克隆抗体的应用特性： 分子结构、氨基酸序列一致， 特异性强，仅识别某一特异的抗原决定簇， 纯度高，效价高，少或无血清交叉反应， 利于实验室标准化，易于大量制备应用： 利用单克隆抗体可进行表位分析 制备检测试剂盒 抑制排斥和自身免疫病 治疗肿瘤、细菌感染 用于分离纯化生物产品HAT培养基作用原理是什么？如何进行单克隆抗体细胞株的筛选。原理：在培养细胞药物抗性突变型中研究得最为广泛的药物
21、抗性是8-氮鸟嘌吟抗性。8-氮鸟嘌吟是一种 鸟嘌吟类似物，当培养基中含有这一药物时，细胞就会由于其结构与鸟嘌吟类似而利用这一药物，将它 掺入到细胞自身的DNA中，最终导致细胞死亡。细胞内参与这一反应的一个重要酶称为（chQng wei）次黄嘌吟鸟嘌吟磷酸核糖转移酶（简称HGPRT）， HGPRT是细胞内嘌吟合成应急途径中的一种酶，它的作用是将次黄嘌吟和鸟嘌吟转变成次黄嘌吟核苷酸或 鸟嘌吟核苷酸，从而使后者参与DNA合成过程。DNA合成（hecheng）途径T队头合成途役一（能被敏基璨畛限断）DNA/一 “补救*途径一:（包含HGPRT和TK阳过程：HAT培养液是在普通（p20ng）培养基里面加
22、上HAT （H为次黄嘌吟Hypoxantbhine ,A为氨基喋吟Aminopterin , T为胸腺嘧啶Thymidine），使脾细胞及骨髓瘤细胞不能繁殖（fdnzhi）而死 亡，但融合的杂交瘤细胞可以大量地繁殖，属选择性培养基。小做脾细施 小律骨At瘤细胞未融含的相互融合的瞬细胞与相互含未融的瞬细胞 脾细胞骨H侑觐聃骨RtflT细胞 骨It偷细胞HGPRT*TK * 代谢完差 墙养不适成HGPRT叮K * 代谭完筌 培养适应HGPRTTK-代谢峡阳培养适应细胸死亡细胞存活、增坦细胞死亡选择培养基的作用原理细胞类型正常培养基卅;HAT 涪养基心5-BitdR培养基&时5培养基正常培舞细胞 T
23、K缺乏细胞 GPRT缺 陷细胞 杂交瘤细胞 y Selective Ablation1 lEwplArYt% from3.5fT dav*2 A M aiden kill s. nc*n-E 零eel 1%.-W松 t3 lEjziAnhan of2：Q4 岑言白，1每号-1-6 wk_w8昏:hZ purvE4 iiriMP -7 w*k.胚胎干细胞培养用饲养(siydng)层细胞有哪些？常用(chdng yong)的饲养层细胞：MEF细胞(mouse embryonic fibroblast)来源于小鼠的12dpc,常用(chdng yong)原代或最初几代(8 代以前)；STO细胞，来源
24、于SIM小鼠对硫代鸟嘌吟和乌本苷有抗性的成纤维细胞系，可分泌干细胞生长因子(SCF)和白血病抑制(yizhi)因子胚胎干细胞在医学中的应用1、哺乳类发育的理想的体外模型ES细胞不仅是研究特定类型细胞分化的模型，而且是研究某些前体细 胞起源和细胞谱系演变较理想的实验体系。2、介导改造动物的基因ES介导基因转移knock out knock in可精确的改造细胞内的基因。3、人体的基因和细胞治疗再生医学一一是一门探索人体组织和器官自身所具有的构建、更新和修复的能力，并使用多种修复技术 手段使人体的组织器官功能得以改善或恢复的新兴学科。包括基因和细胞治疗、组织工程。基因治疗是指用遗传改造过的细胞直接
25、移植或输入病人体内，达到治疗和控制疾病的手段一一细胞治疗 神经系统疾病，骨和软骨疾病，血液病，肝病等成体干细胞包含哪些类别？各有何特点？骨髓干细胞a. 间质干细胞MSC细胞在异常环境中，细胞分化的可塑性增加b. 造血干细胞HSC移植到不同的环境可分化为各种不同类型细胞。神经干细胞神经干细胞是神经系统中一类能自我更新、并产生神经原和神经胶质细胞的前体细胞神经干细胞等只能向一种类型或密切相关的两种类型的细胞分化。说明成体干细胞的分化潜能已经受到 一定限制。肝干细胞表明肝干细胞在适当的微环境中能被诱导分化为内胚层的其他组织细胞。丁酸钠或二甲亚砜可诱导肝干细胞分化为肝细胞转化生长因子(TGF-bata
26、)或肝细胞生长因子(HGF)可诱导(yOudd。)肝干细胞分化为胆上皮细胞骨骼肌干细胞肌肉的生长、更新和修复(xiUfn)是由肌纤维周围的卫星细胞介导的一一即骨骼肌十细胞 骨骼肌十细胞(xibd。)不仅可分化为肌肉，而且可分化为血液细胞成分。具有分化的可塑性成体干细胞在再生医学研究和治疗(zhilid。)技术中有哪些作用？1. 疾病治疗研究干细胞增殖和分化机制的最终目的是应用干细胞治疗疾病。理论上讲，干细胞可以用于各种疾病的 治疗。但其最适合的疾病主要是：组织坏死性疾病如缺血引起的心肌坏死退行性病变如帕金森综合症自体免疫性疾病如胰岛素依赖型糖尿病等。2. 体外制造人体器官干细胞和动物工程的结合
27、将有可能解决这一问题。长生不老的希望目前科学家已能在体外以干细胞为种子培育成功一些组织器官，来替代病变或衰老的组织器官。第八章基因打靶：利用同源重组技术来定点改变物种的基因组顺序和结构，从而在突变的个体内来研究基因及 基因组的功能。基因敲除：是使基因组中某个/某几个基因或基因的顺式元件产生缺陷，从而在突变体内丧失正常的功 能，来推测这些基因或元件原来在体内的功能。干细胞：干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞，可分为胚胎干细胞和成体干细胞。基因敲入：在个体基因组中定点加入某个/某几个基因或顺式元件，使之表达或发挥作用，从而研究该基 因或顺式元件在体内的功能。基因敲出小鼠的技术环节1、获得外源
28、目的基因2、靶向载体3、构建同源打靶重组子4、小鼠ES细胞的准备5、打靶重组子导入ES细胞及药物选择6、靶向基因-ES细胞转入胚泡7、ES-胚胎移入假性怀孕的雌性受体鼠及发育8、嵌合小鼠的近亲交配外源基因如何获得？从基因文库中获取目的基因、利用PCR技术扩增目的基因、通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成。打靶载体的构建方法有哪些？正负双向选择法基因敲除载体和同源重组基因定点整合的正负选择系统条件性基因敲除的意义是什么？ Cre酶系统有什么作用？1“条件性主要由控制Cre酶产生方法来实现，采用不同时空表达专一性的启动子来表达Cre酶，就能 在小鼠发育的特定阶段或特定组织达到某基因敲除的目的。条
29、件基因敲除大大开拓了基因敲除的应用范围，并赋予(fuyu )基因敲除的新的涵义。2在Cre酶存在时，两个loxP位点可以同源重组，切除其中间的部分，留下一个loxP位点。其原理如图 所示。研究发现，在哺乳动物细胞中Cre重组酶也同样能引起（yinqi）DNA联合和位点特异性重组。细胞核移植（动物克隆）的技术环节（hudnjid ）有哪些？概念：将外源基因导入到体细胞中，再将该细胞进行培养，选择其中带有外源基因的细胞进行扩增，用 这种细胞的细胞核进行核移植（把体细胞核植入一个去了核的未受精卵中，融合（r6ngh&）并激活），将 重组胚进行体外培养或者植入同步化的假孕动物的输卵管1）卵丘细胞的去除
30、2）核供体准备3）卵母细胞的去核与注射4）重组胚的融合5）电融合后重组胚的体外培养6）重组胚的移植第九章概念：转基因动物指用人工方法将外源基因导入动物受精卵或早期胚胎细胞，使外源基因与动物本身的基因组整合，并随 细胞的分裂而增殖，从而将外源基因稳定的遗传给下一代的工程化动物。转基因动物实验的常用方法有哪些？1. 显微注射法2. 反转录病毒感染法3. 胚胎干细胞法4. 精子载体法（单精注射）5. 体细胞核移植法转基因动物技术环节包含哪些？显微注射用DNA的制备在体外通过基因重组技术把所需元件进行剪切和拼接而成载体构建应注意：元件的完整受精卵的超排与获取46周母鼠在明暗循环的无特殊病原体动物（SP
31、F）级动物房内饲养35天，即可作超排卵。母鼠的性成熟程度是影响其超排卵的主要因素，一般在35周，卵泡成熟周期已开始，对卵泡刺激素（FSH）有反应的卵泡数达峰值。马孕血清（PMS） +人绒毛膜促性腺素（hCG）转基因鼠的鉴定1、转基因小鼠分析用组织DNA的制备2、PCR鉴定转基因小鼠3、Southern印迹杂交分析法鉴定转基因小鼠纯合子转基因小鼠的建立1、纯合子转基因小鼠的培育第一代转基因动物是杂合的转基因动物，因为外源基因仅在一条染色体上稳定整合。只有通过选种选配，将两个杂合转基因动物成功交配，才能得到纯合转基因动物，建立转基因动物家系，外源DNA才能 在后代中稳定遗传。2、纯合子转基因小鼠的
32、鉴定1）定量PCR鉴定纯合子转基因小鼠2）外源基因拷贝数能通过（tOnggub ）点杂交的定量方法测出3）内源基因（jiyin）和外源基因在Southern杂交膜产生两条带，用放射自显影密度计测量4）应用己克隆的整合位点两侧的宿主基因作为杂交探针（tdn zhen）, Southern杂交分析测定详述胚胎干细胞转导（zhudn dW）法的技术要点。ES细胞是早期胚胎的内细胞团经过体外培养建立起来的多潜能细胞系。将携带有外源基因的ES细胞注 入到动物的早期胚胎内，可产生嵌合体及转基因动物。在ES细胞上的基因操作可以通过逆转录病毒感染、脂质体介导、电穿孔、磷酸钙共沉淀等方法将外源基因导入、细胞。借
33、用ES细胞系可将人们企望的某种不完整的、无功能基因直接引入到ES细胞中，通过细胞增殖、筛选 可得到丧失了某种基因功能的动物后代。克隆羊“多莉”的产生有哪些技术环节？有何意义？克隆羊多利的意义第一，它证明了一个已经完全分化了的动物体细胞仍然保持着当初胚胎细胞的全部遗传信息，并且经此 技术处理后，体细肥恢复了失去的全能性形成完整个体。这就是说哺乳动物业已分化的细胞不具有细胞 全能性的传统概念，在一定条件下是可逆的。第二，多利是世界上首例利用成年哺乳动物体细胞作为供体细胞繁殖的克隆羊，即成体母羊的复制品。 第三，在现代生物学领域中，没有任何一项究成果能够比通过对基因进行有规律地控制而解决更多的问 题
34、的先例。若聆皿怛c riw 1克隆人研究可行吗？，克隆的爱因斯坦会是否懂得“相对论”？第十章概念：染色体组工程：人们按照一定的设计，有计划地消减、添加或代换同种或异种染色体,从而达到定向改变遗传特性和选育 新品种的一种技术。酵母人工染色体酵母染色体稳定的三要素：着丝点、端粒和复制点YAC载体基本序列元件：1.自主复制顺序（ARS）:负责DNA复制2.着丝粒顺序（CEN）:保证酵母细胞 分裂时染色体的分配3.端粒顺序（TEL）：（两端各一个）维持染色体结构的稳定性4.选择标记：用于 重组克隆的筛选细菌人工染色体是以大肠杆菌的单拷贝F因复制子为基础构建的一个克隆容量可达300 kb的人工载体。哺乳
35、类人工染色体，是以哺乳动物细胞作为宿主细胞的人工（rengong）染色体技术，作为异源DNA片段的载体，比YAC容量 大。细胞核移植（yizhi）将外源基因导入到体细胞中，再将该细胞进行培养，选择其中带有外源基因的细胞进行扩增，用 这种细胞的细胞核进行核移植(把体细胞核植入一个去了核的未受精卵中，融合并激活)，)，将 重组(zh而9 zu)胚进行体外培养或者植入同步化的假孕动物的输卵管雄核发育(fdyd)是指因经过紫外线、X射线或Y-射线处理的卵子与正常的精子受精，再在适当时间施以冷，热或高压等 物理处理，使进入卵子内的精子染色体加倍，而发育为完全为父本性状的二倍体。相比之下，雄核发育 研究比
36、雌核发育要少得多。雌核发育俗称假受精，意指精子虽然正常地钻人和激活卵子，但精子的细胞核并末参与卵球的发育，精子的染色 体很快消失，胚胎的发育仅在母体遗传的控制下进行。多倍体是指每个体细胞中含有三个或更多染色体组的个体而言。酵母人工染色体的结构和功能各有哪些特点？有什么用途？YAC克隆系统的特点1 YAC作为可提供大片段DNA的方法，简化了构建染色体延伸区域图谱和分离完整基因的过程2用酵母为宿主重新构建大的人类基因区段，可将小的重叠的YAC变成一个大的YAC3酵母作为一种真核生物，为其它真核的DNA提供了更合适的环境YAC的主要用途是：(1) YAC克隆重叠群是物理图谱的主要框架。它不仅可容纳大
37、片段的外源DNA，而且在构建基因组文库时 需要较少的克隆。用YAC克隆构建的物理图谱在复杂的生物基因组分析和DNA测序中发挥着重要作用。目前，用YAC提 供大片段DNA构建染色体图谱的技术已在人类、植物、昆虫、鸟类、两栖类等动物中得到广泛应用，相 比于早期的DNA片段载体，YAC是容纳大片段外源DNA的首选载体。(3)在基因功能研究中，基因嵌入及转基因技术都采用了 YAC克隆系统。通过YAC嵌入的基因不仅片段 长，而且嵌入的基因更适于体内表达，并有利于基因保持其固有的空间构象和功能的发挥。人工诱导鱼类多倍体的方法有哪些？生物学方法物理学方法化学方法人工诱导雌、雄核发育人工诱导鱼类多倍体有什么意
38、义？那些方法可有效诱导鱼类多倍体？具有良好的生存力和生长率种间杂种生长快，可以同时具有两个不同种的优良特性三倍体预期是不育的，许多实验也都证明了这一点，生产上可以利用这个不育特性，将生殖腺发育消耗 的能量用于动物生长上，避免因繁殖季节及肉质下降而延误上市时间或影响商品价值，也避免了生长停 滞和死亡率的增高，缩短了养殖周期，减少了养殖成本，可养成大型个体。第十一章概念：胚胎移植也称受精卵移植，是将良种母畜配种后的早期胚胎取出，移植到具同种生理状态的母畜体内，使之继续 发育成新个体试管动物指利用精、卵体外受精、胚胎体外培养，体外发育到一定程度的胚胎移植入受体获得的各种动物体外受精人为地把成熟的卵母
39、细胞与精子在合适的体外环境中共同培养一段时间，完成受精。胚胎分割把胚胎(pQitdi)用显微手术分割为二，甚至分割为四或八，以获得同卵双生或多生的后代，也是胚胎克 隆的一种方法。动物(dbnM)克隆动物克隆技术(jishn)主要指细胞核移植，包括胚胎分割技术。动物克隆依据其目的分：繁殖性克隆和治 疗性克隆试管婴儿(shi 9U如 ying Or)指分别将卵子与精子取出后，在体外(培养皿中)使其受精，并发育成胚胎后，再植回母体子宫内，发育 成的婴儿。超数排卵的方法有哪些？促卵泡素(FSH)减量注射法PMSG 法胚胎冻存的方法有哪些？常规冻存冻存液：1.4mol/L 甘油+ PBSS (含 20%
40、NCS 的 PBS)玻璃化(vitrification )法玻璃化溶液：25%甘油、25%PROH (1，2-丙二醇)或25%乙二醇体外受精包含哪些技术环节？卵母细胞的获得和体外成熟精子的体外获能成熟卵母细胞与获能精子的体外受精受精卵的体外培养受精卵的移植试管婴儿的主要技术环节有哪些？1、超排卵2、卵泡监测3、取卵手术4、精卵体外处理5、体外受精6、胚胎的体外培养7、胚胎移植以胚胎工程技术为核心的生物育种的方法有哪些？胚胎移植技术胚胎冷冻技术胚胎分割技术体外受精技术动物克隆技术胚胎移植的意义1) 发挥优良母畜的繁殖潜力一借腹怀胎2) 促进家畜改良的速度一快速繁殖3) 代替种畜的引进，保存品种资源：长期保存冷冻胚胎，便于运输和保存遗传资源，改变家畜种群的遗 传组成，防止近亲繁殖造成的种群退化4) 胚胎生物技术的基础一试管畜、转基因畜、克隆畜等内容摘要(1)动物细胞工程第一章概念：动物细胞工程：是指以动物细胞、细胞器或早期胚胎为研究对象，应用细胞生物学和分子生物学 原理和方法，对其进行培养、繁殖、人工操作等，使其产生人们所需的生物学特征，获得人类所 需的生物产品、创造新的细胞类型或动物品种的一门综合科学
