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1、第六节 原核生物的基因重组,基因重组（gene recombination）：将两个不同性状个体的基因通过一定的方式转移到一起，并发生重新组合，产生新的遗传性状的过程，称为基因重组(gene recombination)或遗传重组。重组：遗传物质在分子水平上发生的交换；杂交：在细胞水平上遗传物质的交换.杂交必然包含着重组，但重组不仅限于杂交这一形式。,原核生物的基因重组类型,4种形式：1）转化 2）转导 3）接合 4）原生质体融合,一、转化（transformation）,定义：受体细胞直接吸收供体细胞的DNA片段,并与其染色体同源片段进行遗传物质交换，从而使受体细胞获得新的遗传性状的现象。,
2、转化子（transformant）：经转化后出现了供体性状的受体细胞称为转化子，即转化成功的菌落。,目前已知有二十多个种的G+和G-细菌具有自然转化的能力此过程可以发生在土壤和海洋环境中，可能是自然界遗传交换的重要方式。,自然遗传转化（natural genetic transformation）,人工转化（artificial transformation）,感受态细胞（competent cell）：具有摄取外源DNA能力的细胞,1.感受态,感受态：是指受体细胞最易接受外源DNA片段并能实现转化的一种生理状态。一个细菌能否出现感受态是由其遗传性决定的，但受环境条件的影响也很大，因而表现差别
3、很大。,感受态因子：调节感受态的一类特异蛋白，它包括三种主要成分：膜相关DNA结合蛋白、细胞壁自溶素和几种核酸酶。,自然感受态与人工感受态的不同？,自然感受态的出现是细胞一定生长阶段的生理特性（如肺炎链球菌的感受态出现在对数生长期）受细菌自身的基因控制,人工感受态则是通过人为诱导的方法，使细胞具有 摄取DNA的能力，或人为地将DNA导入细胞内。（该过程与细菌自身的遗传控制无关！）,进行自然转化，需要二方面必要的条件：,（1）建立了感受态的受体细胞,（2）外源游离DNA分子,感受态的机理研究：,局部原生质体化假说：处于感受态的细胞局部失去了细胞壁，使外源DNA能顺利经膜进入菌体。,酶受体假说：受
4、体细胞表面出现了一种能结合DNA并使之进入细胞的酶。,2.转化模型,（1）转化因子 本质是离体的DNA片断或质粒DNA。转化因子进入细胞前还会被酶解成更小的片段，约8kb。在不同的微生物中，转化因子的形式不同，dsDNA,ssDNA.革兰氏阴性的嗜血杆菌中，细胞只吸收dsDNA形式的转化因子，但进入细胞后需经酶解为ssDNA，才能与受体菌的基因组整合；革兰氏阳性的链球菌和芽孢杆菌中，dsDNA的一条链必须在胞外降解，只有ssDNA形式的转化因子才能进入细胞。但不管何种情况，最易与细胞表面结合的仍是dsDNA。由于每个细胞表面能与转化因子相结合的位点有限（如肺炎链球菌约10个），因此，从外界加入
5、无关的dsDNA就可竞争并干扰转化作用。质粒DNA也是良好的转化因子，但它们通常并不能与核染色体组发生重组。转化的频率通常为0.11，最高为20。,(2)转化过程,肺炎链球菌转化的主要过程,转化因子进入细胞,转化因子单链配对与整合,复制,分离,自然转化过程的特点：,a）对核酸酶敏感；,c）转化是否成功及转化效率的高低主要取决于转化（DNA）给体菌株和转化受体菌株之间的亲源关系；,d）通常情况下质粒的自然转化形成转化子效率要低得多；,提高质粒的自然转化效率的二种方法：1）使质粒形成多聚体，这样进入细胞后重新组合成有 活性的质粒的几率大大提高；2）在质粒上插入受体菌染色体的部分片段，或将质粒转化进
6、含有与该质粒具有同源区段的质粒的受体菌-重组获救,b）不需要活的DNA给体细胞；,定义：噬菌体DNA被感受态细胞摄取并产生有活性的病毒颗粒。,4.转染(transfection)：,现在把DNA转移至动物细胞的过程也称转染,提纯的噬菌体DNA以转化的（而非感染）途径进入微生物细胞并表达后产生完整的病毒颗粒。,特点：,5、人工转化,用CaCl2处理细胞，PEG介导、电穿孔、基因枪法等是常用的人工转化手段（使细胞膜更易于透过DNA）。,在自然转化的基础上发展和建立的一项细菌基因重组手段，是基因工程的奠基石和基础技术。,不是由细菌自身的基因所控制；,用多种不同的技术处理受体细胞，使其人为地处于一种可
7、以摄取外源DNA的“人工感受态”。,质粒的转化效率高（不像线型DNA 那样易于降解，而且还能在宿主中复制。任何来源的DNA 将其连接到质粒上都能进入受体细胞）.,二、转导（transduction）,转导：利用完全或部分缺陷噬菌体为媒介，把供体细胞的小片段DNA携带到受体细胞中，通过交换与整合，使后者获得前者部分遗传性状的现象。,由转导作用而获得供体细胞部分遗传性状的重组受体细胞称为转导子（transductant）携带供体部分遗传物质（DNA片段）的噬菌体称为转导噬菌体。,细菌转导的二种类型：,普遍性转导,局限性转导,1、普遍性转导（generalized transduction）,通过极
8、少数完全缺陷噬菌体对供体菌基因组上任何小片段DNA进行误包，而将其遗传性状传递给受体菌的现象，称普遍性转导。,(1)意外的发现,1951年，Joshua Lederberg和Norton Zinder为了证实大肠杆菌以外的其它菌种是否也存在接合作用，用二株具不同的多重营养缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌LT22A(trp-)（P22）和LT2(his-)进行实验：,用“U”型管进行同样的实验时，在供体和受体细胞不接触的情况下，同样出现原养型细菌！,沙门氏菌LT22A(trp-)是携带P22噬菌体的溶源性细菌 另一株LT2(his-)是非溶源性细菌,一个表面看起来的常规研究却导致一个惊奇和十分重要发现的重
9、要例证！,基因的传递很可能是由可透过“U”型管滤板的P22噬菌体介导的(在接种LT22A的一端出现了原养型),（普遍性转导这一重要的基因转移途径的发现）,(2)转导模型,转导噬菌体为什么“错”将宿主的DNA包裹进去?,噬菌体的DNA包装酶也能识别染色体DNA上类似pac的位点并进行切割，以“headful”的包装机制包装进P22噬菌体外壳，形成只含宿主DNA的转导噬菌体颗粒（假噬菌体）。,因为染色体上的pac与P22 DNA的pac序列不完全相同，利用效率较低，这种“错装”机率一般仅约10-6-10-8,形成转导颗粒的噬菌体可以是温和的，也可以是烈性的，但必须具有能偶尔识别宿主DNA的包装机制
10、，并在宿主基因组完全降解以前进行包装。,普遍性转导的基本要求：,普遍性转导的三种后果：,进入受体的外源DNA通过与细胞染色体的重组交换而形成稳定的转导子,流产转导（abortive transduction）,转导DNA不能进行重组和复制，但其携带的基因可经过转录而得到表达。,特点：在选择培养基平板上形成微小菌落,外源DNA被降解，转导失败。,如果受体菌通过普遍转导获得了供体菌DNA片段后，在其体内不发生基因的交换、整合和复制，只进行转录、翻译和性状的表达。这种转导被称为流产转导.,2.局限转导（restricted transduction）定义：通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数 特定
11、基因携带到受体菌中，并与后者的基因 组整合、重组，形成转导子的现象。媒介：部分缺陷噬菌体（丢失自身一部分基因，并被 同等长度的宿主基因所取代）只能转导个别特定基因,大肠杆菌中噬菌体的正常裂解及半乳糖基因转导噬菌体的形成过程,低频转导（LFT）的定义:诱导溶源性大肠杆菌而产生的细胞裂解产物中，除含有正常的噬菌体外，还有少数（10-6）转导噬菌体颗粒，因此，用诱导溶源性菌株得来的噬菌体进行转导时的转导频率不过10-6，称为低频转导。,高频转导(HFT):如果细菌染色体中整合有一个正常的噬菌体时，缺陷噬菌体也能整合到同一细菌染色体上（因为正常噬菌体整合后，产生两个细菌/噬菌体杂合att位点，缺陷噬菌
12、体可以在该位点插入），这种细菌称为双重溶源菌.双重溶源菌中，正常噬菌体称为辅助噬菌体，因为它帮助缺陷噬菌体整合和繁殖。双重溶原菌在紫外辐射等因子的诱导下,原噬菌体容易被切割下来，产生等量的缺陷噬菌体和正常噬菌体，该裂解物称为高频率转导裂解物，用这样的裂解物去感染细菌，将比低频率转导裂解物产生多得多的转导子。这一过程称为高频转导。,大肠杆菌的低频转导和高频转导比较：uv E.coli K12()LFT 裂解物 dg(10-5 10-6)转导噬菌体 uv E.coli K12(/dg)HFT裂解物 50%(双重溶源菌)50%dg转导噬菌体 低频率转导（LFT）：LFT裂解物 E.coli gal-
13、E.coli gal-/dgal+（极少量转导子菌落)E.coli gal-高频率转导(HFT)：HFT裂解物 E.coli gal-E.coli gal-/dgal+（50%转导子菌落)E.coli gal-（50%）,普遍转导与局限转导的特性比较,溶源转变（lysogenic conversion）：,一个与转导相似又不同的现象,定义:温和噬菌体感染细胞后使之发生溶源化，因噬菌体的基因整合到宿主染色体上，而使后者获得了新性状的现象。,溶源转变与转导的不同？,a）噬菌体不携带任何供体菌的基因；,b）这种噬菌体是完整的，而不是缺陷的；,三、接合(conjugation),通过细胞与细胞的直接接
14、触而产生的遗传信息的转移和重组过程,1.接合现象的发现和证实,1946年，Joshua Lederberg 和Edward L.Taturm细菌的多重营养缺陷型杂交实验,中间平板上长出的原养型菌落是两菌株之间发生了遗传交换和重组所致！,为了减少所培养的结果是回复突变的机会，采用了双重或三重营养缺陷型。该实验是建立在不大可能同时发生两种或三种回复突变的设想上的。,证实接合过程需要细胞间的直接接触的“U”型管实验（Bernard Davis，1950）,2.能进行接合的微生物种类,主要在细菌和放线菌中存在。在细菌中，G 细菌尤为普遍，如E.coli、沙门氏菌属、志贺氏菌属、克雷伯氏菌属、沙雷氏菌属
15、、弧菌属、固氮菌属和假单胞菌属等；放线菌中，以链霉菌属和诺卡氏菌属最为常见，其中研究得最为详细的是天蓝色链霉菌（Streptomyces coeilcolor）。在不同属的一些菌种之间也可发生接合现象，如大肠杆菌与鼠伤寒沙门氏菌间或沙门氏菌与痢疾志贺氏菌间。在所有对象中，接合现象研究得最多、了解得最清楚的是E.coli。E.coli 是有性别分化的，决定性别的是其中的F质粒，F质粒还是合成性菌毛基因的载体。,3.大肠杆菌的接合型与接合,细菌遗传重组单向过程和F因子的提出 F菌株,F菌株,Hfr菌株,F因子结构图:相对分子质量通常为5107，上面有编码细菌产生性菌毛及控制接合过程进行的20多个基
16、因。图中黄色区域表示转座子，通过这些部位可以整合进细菌染色体上形成各种Hfr菌株。,Hfr菌株:细胞中的F质粒整合到核染色体组上,与F 菌株相接合后，发生基因重组的频率比任何已知的F 与F 接合后的频率高出几百倍，这种“雄性”菌株称为Hfr。,在Hfr菌株与F-细胞进行接合时,OriT序列被缺刻螺旋酶识别而产生缺口后，F因子的先导区(leading region)结合着染色体DNA向受体细胞转移，F因子除先导区以外，其余绝大部分是处于转移染色体的末端，由于转移过程常被中断，因此F因子不易转入受体细胞中，故HfrF-杂交后的受体细胞大多数仍然是F-（即不能使受体菌变成供体）。,接合中DNA转移过
17、程有着稳定的速度和严格的顺序性。染色体上越靠近F因子的先导区的基因，进入的机会就越多，在F-中出现重组子的的时间就越早，频率也高。,中断杂交（interrupted mating）技术和基因定位,利用HfrF-的接合过程，在不同时间取样，并把样品猛烈搅拌以分散接合中的细菌，然后分析受体细菌基因型，以时间(分钟)为单位绘制遗传图谱，该图谱是细菌染色体上基因顺序的直接反映。,左图:不同Hfr菌株的形成方式，以不同的起点不同的顺序转移基因。（a）细菌染色体为环状，可以不同的IS位点打开，F质粒插入进去。（b）Hfr菌株的部分基因顺序。,大肠杆菌基因组很大（全部转移需要100分钟），其遗传图谱须用多株
18、F因子整合在不同位置的Hfr菌才能完成,基因定位：通过遗传重组等手段确定不同的基因在染色体上的位置及相对距离，从而获得遗传图谱。,连锁的二基因间的距离与其共转化，或共转导的频率成反比，因此，可根据二个基因被共转化或共转导的频率判断它们在染色体上的相对距离。,接合作用（中断杂交）作图只能判断相距较远的基因间的相对位置；转导、转化则可用于对相隔很近的基因进行定位；,大肠杆菌遗传图谱,目前对大肠杆菌的染色体已定位了1000多个基因,F菌株,F菌株:Hfr菌株内的F因子因不正常切割而脱离染色体时，形成游离的但携带一小段染色体基因的F因子，特称为F因子。细胞表面同样有性菌毛。,FF-与F+F-的不同：给
19、体的部分染色体基因随F一起转入受体细胞,细胞基因通过F和F-的接合而实现转移的过程常称为性导（sexduction）、F因子转导，或F因子介导的转导（F-mediated transduction）。,F所带的基因可以与染色体发生重组；也可以继续存在于F因子上。,F质粒的四种存在方式及相互关系,接合(conjugation)：,细胞与细胞的直接接触（由F因子介导）,转导(transduction)：,由噬菌体介导,自然遗传转化(natural genetic transformation)：,游离DNA分子+感受态细胞,“接合”“转导”及“自然转化”这三种在自然界中存在的细菌遗传重组过程各自的特点：,a）外源DNA的来源及进入途径有差异；,b）决定因素也各有不同；,如何设计实验对三种途径进行区分？,
