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1、1,第四章,基因工程的工具酶及其应用,2,TOOLS FOR GENE CLONINGSCISSORS:RESTRICTION ENZYMES GLUE:DNA LIGASE VEHICLE:PLASMID OR VIRAL VECTORS,3,基因工程的工具酶定义 用于DNA和RNA切割和连 接的各种酶叫做工具酶。,4,“分子剪刀”的发现者,5,第一节 限制性核酸内切酶,限制性核酸内切酶(restriction endonuclease，RE)是由细菌自己产生的一种能识别双链DNA中的特定序列，并以内切方式水解核酸中磷酸二酯键的核酸内切酶。,6,在细菌体内，这种内切酶可以分解外源性的DNA物
2、质，例如病毒等；而细菌本身的DNA同一识别序列中的某些碱基被甲基化所保护。这种细菌内部的限制与修饰作用分别由核酸内切酶和甲基化酶完成，构成了类似免疫的防御系统。,7,解释 何谓内切酶-o-o-o-o-o-o-o-o-o-o-o-o-o-o-红色为外切酶的作用位点，蓝色为内切酶的作用位点,8,限制性核酸内切酶的分类,目前已发现的限制性核酸内切酶600余种，可分为三大类。类限制性核酸内切酶广泛用于基因工程；特点：识别切割位点比较专一，只有切割作用。无甲基化修饰作用。类和类限制性核酸内切酶同时具有内切活性和甲基化修饰活性，且识别位点复杂，特异性差，不适用于基因工程。,9,一.限制性内切酶的命名,Hi
3、nd H in d,细菌属名的第一个字母,细菌种名的前两个字母,细菌菌株的第一个字母,同一菌株中发现的第三种酶,10,EcoRI E co R I,细菌属名的第一个字母,细菌种名的前两个字母,该酶的基因位于R质粒上,该菌株发现的第一种内切酶,11,12,二.II型限制酶的识别特点,识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序的固定位置切割，识别顺序为回文结构。（Palindrome）,客上天然居居然天上客,13,14,EcoRI,PstI,HpaI,5 sticky end 5粘末端,3 sticky end 3粘末端,blunt end 平末端,三.限制性内切酶的切割方式,15,四.识别位点与切割方式,
4、限制性内切酶识别序列一般为6个核苷酸，如EcoRI，HindIII，BamHI，居多数。也有少数限制性内切酶，识别序列为4个、5个、或更多的核苷酸如8个及8个以上，当识别序列核苷酸数为单数时，则以中间的核苷酸作为对称轴。如GTNAC（N 代表四种核苷酸）。,16,一般说来，在DNA分子中，识别序列短的出现概率大，识别序列长的出现概率小。有N个核苷酸的识别序列出现概率为1/4n。如识别4个核苷酸Sau 3A，则间隔256（4444）个核苷酸就有一次机会出现识别位点。如识别8个核苷酸的Not I，则需间隔65536个核苷酸才有一次机会出现识别位点。,17,稀切酶：有些酶的识别位点在核苷酸序列中出现
5、的几率很小，可称为稀切酶。为了获得大的DNA片段，需用稀切酶切割。个别限制性内切酶可识别两种以上的核苷酸序列，如Acc I既可识别GTATAC，又可识别GTCGAC。,18,位点偏爱：限制性内切酶识别序列两侧的核苷酸组成与酶切效率有关，比如Nae I在pBR322质粒上有4个识别位点，其中两个位点可迅速被Nae I切割。第三个位点稍慢。而位于1285处的第四个识别序列，切割的效率只有其他位点的1/15。,19,同尾酶：两种酶识别不同的顺序，但切割 产生的粘末端相同，叫做同尾酶。同尾酶产生的粘末端，可通过碱基互补连接，形成的位点称为“杂种位点”，该位点不能再被原来的两种酶切割。,20,例：AGA
6、TCT GGATCC TCTAGA CCTAGG,Bgl,BamH,ATCTAG,GATCC G,连接酶,AGATCCTCTAGG,21,同位酶:识别相同的序列,但切割位点不同.同裂酶:又称异源同工酶，来源不同,但识别位点和切割位点相同.切割位点也可以不同，例如Sam I(CCCGGG)和Xma I(CCCGGG),22,五.限制性内切酶的反应条件,反应温度 一般为37oC反应体积20lDNA含量 0.51g酶含量 12uDNA纯度：OD260/280nm1.7 阳离子 Mg2+反应时间 1-1.5hpH7.5,23,限制性核酸内切酶的反应条件,各种限制性核酸内切酶反应条件相似，主要区别是对盐
7、浓度的需求不同。据此可分为三组低盐组 050mmol/L NaCl中盐组 50100mmol/L NaCl高盐组 100150mmol/L NaCl,24,限制性核酸内切酶的星号活性,当酶切条件发生变化时，限制性核酸内切酶的专一性可能会降低，导致同种酶识别多种序列，这种现象称作限制性核酸内切酶的星号活性。,25,例如 EcoR I在正常条件下识别GAATTC,但在低盐（小于50mmol/L)、高pH（大于8）、甘油大量存在时，识别序列增加了AAATTC、GAGTTC,导致EcoR I在DNA分子上的切割位点大大增加。,26,第二节 其他工具酶,一.DNA聚合酶作用:依据模版,连接游离的单核苷酸
8、,形成与 模版互补的新链。,27,1.大肠杆菌DNA聚合酶该酶具有三种酶活性 53 DNA聚合活性 35 外切酶活性 识别切除错配的核苷酸 53 DNA外切酶活性,28,5CCGATA-OH 33GGCTATCGGA 5CCGATAGCCT 33GGCTATCGGA53 DNA聚合酶活性,DNA聚合酶,dNTP,29,5CCGATA-OH 33GGC DNA聚合酶5CCG3GGC dA,dT35 外切酶活性,30,2.大肠杆菌DNA聚合酶大片段,该酶是用枯草杆菌蛋白酶或胰蛋白酶降解大肠杆菌DNA聚合酶，从全酶中切去 5 3 外切活性的肽段后产生的一条多肽链，保留了53聚合和35外切活性。该酶称
9、为Klenow酶。也称为 Klenow 片段（Klenow fragment）。,31,3.T4噬菌体DNA聚合酶,来源于T4噬菌体感染的大肠杆菌，具有 53 DNA聚合酶活性35 外切酶活性,32,4.TaqDNA聚合酶,耐热的 DNA聚合酶。最适反应温度7580oC，主要用于聚合酶链反应。,33,5.逆转录酶（reverse transcriptase）,作用：以RNA为模版，合成 cDNA(Complementary DNA)该类酶有三种活性 RNA依赖的DNA聚合酶活性 DNA依赖的DNA聚合酶活性 外切RNA的活性,34,常用的逆转录酶有两种：AMV来自于鸟类骨髓母细胞瘤病毒 M-M
10、LV来自于莫络尼鼠的白血病病毒,35,二.T4DNA连接酶,催化两个DNA片段的3-OH和5-P末端 形成磷酸二酯键该酶是大肠杆菌T4噬菌体的DNA30编码的产物，分子量68kd。现已由基因工程菌表达。,36,DNA 连接酶,“分子针线”,37,DNA连接酶,连接的部位：磷酸二酯键（梯子的扶手），不是氢键（梯子的踏板）。,38,主要功能降解RNA 由于RNA酶分布广泛，如唾液、皮肤分泌物中都含此酶，在涉及RNA的实验中谨防RNA酶污染。,三.RNA酶,39,四.核酸酶SI,降解单链 DNA 或 RNA，形成5-P的单核苷酸或寡核苷酸片段对DNA的活性比对RNA的强产生平末端,40,五.碱性磷酸酶,切除DNA或RNA的5-P防止DNA自身环化,5 p TTAGCTAGGCCC TCAATCGGTACG OH 33 HO-AATCGATCCGGG AGTTAGCCATGCp 5,
