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1、第四章 基因操作中大分子的分离和分析,第一节 DNA的分离、检测和纯化,第四章 基因操作中大分子的分离和分析,一、大肠杆菌质粒DNA的分离和纯化,1.碱裂解法提取E.coli质粒DNA2.通过试剂盒分离纯化E.coli质粒DNA,1.碱裂解法提取E.coli质粒DNA,原理：碱变性法提取主要是利用共价闭合环状质粒与线性染色质在拓扑学上的差异：在碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而共价闭环质粒DNA仍为自然状态；将pH调至中性并有高浓度盐存在的条件下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构，大部分DNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍为可溶状态。通过离心可除去
2、大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，再用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。,由于操作原因，提取的质粒可有三种结构：线形、开环、闭环超螺旋,质粒提取,（一）仪器：恒温培养箱、恒温摇床、超净工作台、台式离心机、高压灭菌锅（二）材料：含pUC18（或其他）质粒的大肠杆菌（三）试剂：LB培养基（液体、固体）溶液I溶液II溶液IIITE(pH8.0),操作步骤,接含pUC18(或pET21a)质粒的单菌落于3ml LB Amp+液体培养基中370C，190rpm振荡培养过夜取1.5 ml菌液入1.5ml的离心管中 6000rpm、离心2min，弃上清，收集菌体100uL溶液
3、I悬浮菌体（充分振荡），室温（或冰浴）10min加入200uL溶液II（轻轻混匀），冰上静置5min裂解菌体,加入150uL溶液III（轻轻混匀），冰上静置15min质粒DNA复性12000rpm，离心15min，取上清记录体积到一新管上清加等体积的酚：氯仿：异戊醇（振荡混匀）12000rpm，离心15min，取上清记录体积到一新管（可省略）上清加等体积的氯仿：异戊醇（振荡混匀）12000rpm，离心15min，取上清记录体积到一新管上清加2倍体积的无水乙醇（充分混匀），冰浴 30min,12000rpm，离心15min沉淀用75%乙醇1mL洗涤两次（轻弹混匀、离心）12000rpm，离心10
4、min晾干沉淀沉淀用20ul TE溶解，-200C保存,2.通过试剂盒分离纯化E.coli质粒DNA,二、电泳检测,（一）DNA的琼脂糖凝胶电泳（二）聚丙烯酰胺电泳（三）脉冲场凝胶电泳,（一）DNA的琼脂糖凝胶电泳,琼脂糖凝胶天然琼脂（Agar）是一种多聚糖，主要由琼脂糖（Agarose，约占80）及琼脂胶（Agaropectin）组成。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷。琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产生较强的电渗现象，加之硫酸根可与某些蛋白质作用而影响电泳速度及分离效果。琼脂糖透明无紫外吸收，因此，目前多用琼脂糖为电泳支持物进行
5、平板电泳。,琼脂糖凝胶浓度与线性DNA分辨范围,核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系,不同构型DNA的移动速度依次为：共价闭环超螺旋DNA（cccDNA）直线DNA（LDNA，2条链发生断裂）开环的双链环状DNA（ocDNA，1条链发生断裂）。,影响迁移率的因素,DNA分子的大小、琼脂糖凝胶的浓度、DNA的构象、所加电压（一般5V/cm）、电场方向、嵌入染料的存在、电泳缓冲液的组成等。,常用染料,EB:溴化乙锭EB能插入DNA分子碱基对之间，导致EB与DNA结合。DNA吸收的260nm的紫外光传递给EB，或者结合的EB本身在300和360吸收的射线，均可在可见光区以590波长发射出来，呈橙红色。
6、EB染料优点：染色操作简便，快速，室温下15-20min；不会使核酸断裂；灵敏度高，10ng或更少的DNA即可检出；可以加到样品中可胶中。EB是诱变剂，使用时一定要戴手套。EB废液要经过处理才能丢弃。,SYBR:新型低毒，高灵敏度染料，加入样品中，价格较昂贵。SYBR Green I是高灵敏的DNA荧光染料，适用于各种电泳分析，操作简单：无须脱色或冲洗。至少可检出20pg DNA，高于EB染色法25-100倍。,由于操作原因，提取的质粒可有三种结构：线形、开环、闭环超螺旋,提纯和未提纯质粒DNA电泳图,pGFP pBSK M,（二）聚丙烯酰胺电泳,（三）脉冲场凝胶电泳,三、DNA片段的纯化,1
7、低熔点琼脂糖凝胶电泳法低熔点琼脂糖在水溶液中的溶解温度（melting point）很低，在 65 以下；当温度降低到 20-30 时凝结成固形物。如果需要分离特定的 DNA 片段，可用低熔点琼脂糖凝胶进行分析，然后切割带有目标 DNA 的琼脂糖凝胶块，加入适量缓冲液，加热到 60，凝胶溶化，DNA 进入水溶液中，最后通过苯酚/氯仿抽提和乙醇沉淀获得纯化的 DNA 片段。,2透析袋电洗脱法将含有目标DNA片段的琼脂糖凝胶块切割下来，放在透析袋中，置于电泳缓冲液中电泳，DNA 将从凝胶块中“跑”出来。常用于回收 5kb 以上的 DNA 片段。,3Glass Milk（bead）结合法琼脂糖凝胶在
8、 3 倍体积的 3M NaI 溶液作用下于 55 会溶化，从而将 DNA 释放到水溶液中；在这样的高盐浓度下，有一种硅珠 可特异性吸附 DNA。当硅珠吸附 DNA 后，通过离心的方法很容易对硅珠进行洗涤，然后用水或低盐缓冲液可从硅粒中将吸附的 DNA 洗脱出来。4Qiagen 纯化柱,第二节 RNA的分离、检测和纯化,第四章 基因操作中大分子的分离和分析,一、控制潜在的 RNA 酶的活性,1溶液和用具的去 RNA 酶处理用 0.1%焦碳酸二乙酯（DEPC）处理过的水浸泡后再灭菌，或购买无 RNA 酶污染的用具。对于电泳用具最好使用专用的，不要用于其它分析，在使用之前用洗涤剂洗涮干净，再用 3%
9、H 2O2 和 0.1%DEPC 处理的水浸泡，清洗干净。,2RNA 酶抑制剂的使用为了进一步防范 RNA 降解，一般在 RNA 样品和 RNA 反应中加入 RNA 酶抑制剂，现在应用较多的是蛋白类抑制剂，如人胎盘 RNase 抑制剂。除此之外，还有氧铜核糖核苷复合物（完全抑制剂，且抑制体外翻译）和硅藻土（吸附 RNase 吸附剂）。,二、RNA的抽提和纯化,1酚-异硫氢酸胍抽提法TRIZOL 试剂是使用最广泛的抽提总 RNA 的专用试剂由 Gibco 公司根据酚-异硫氢酸胍抽提法设计，主要由苯酚和异硫氢酸胍组成对任何生物材料的 RNA 提取，首先研磨组织或细胞，或使之裂解；加入该试剂后，可保
10、持 RNA 的完整，同时进一步破碎细胞并溶解细胞成分；加入氯仿抽提，离心，水相和有机相分离；收集含 RNA 的水相；通过异丙醇沉淀，可获得 RNA 样品。,组织RNA的提取：把液氮冻存的组织放到冰冻的碾钵中碾碎，加入适量的Trizol 试剂（1mL/100mg组织）裂解组织，冰上放置5 min。吸入1.5mL离心管中，加入氯仿(0.2mL/mL Trizol)，冰上放置5 min。10 000g离心10 min，吸取上清于另一离心管，加入等体积的异丙醇，室温放置10 min。10 000g离心15 min，去上清，70%乙醇洗涤沉淀，室温风干，加DEPC处理的双蒸水溶解。,2硅胶膜纯化法RNe
11、asy 试剂盒是由 Qiagen 公司设计其设计思路与 DNA 的分离纯化思路相似 含有目标核酸的细胞破碎液通过硅胶膜时，核酸吸附在硅胶膜上，从而与其它细胞成分分开然后在低盐浓度下核酸可从硅胶膜上洗脱出来。,三、mRNA的纯化,mRNA 的纯化主要是针对真核生物而言的由于真核生物 mRNA 的 3 端有一个 poly（A）尾可用亲和层析的方法纯化有许多类型的商业化层析柱可用于 mRNA 的纯化。,四、RNA的电泳检测,RNA 的浓度和纯度可通过测试其OD260 来判断OD260 为 1 时相当于浓度为 40 mg/ml。要直观地观察 RNA 的存在以至于分析，可通过琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝
12、胶电泳来完成。,1琼脂糖凝胶电泳通过琼脂糖凝胶电泳进行 RNA 分析和 DNA 分析的原理是类似的。不同的是，RNA 分析是在变性的条件下进行的。常用的变性剂为甲醛，也可使用氢氧化甲基汞和乙二醛-二甲基亚砜（DMSO）。2聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳主要用来分析小分子量的单链核酸，如小分子量 RNA 寡核苷酸、DNA 序列分析等。其变性条件可用加热方式，或使用尿素等变性剂。,电泳检测结果有三条清晰的rRNA 带：28S，18S和5S，表明RNA未降解,Total RNA,第三节 分子杂交,第四章 基因操作中大分子的分离和分析,Southern杂交Northern杂交Western杂交,
13、一、Southern杂交,DNA杂交探针为 DNA 或 RNA,1转膜当目标 DNA 经过限制性酶切并通过琼脂糖凝胶电泳以后，在 0.4N NaOH 碱性条件下变性，再在 1.5M NaCl/1M Tris（pH7.4）条件下中和使 DNA 仍保持单链状态。然后通过毛细管渗吸或电转移或真空转移的方式，将凝胶上的 DNA 转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上。最后通过 80 处理或紫外线照射将 DNA 固定在滤膜上,2分子杂交预杂交将结合了 DNA 分子的滤膜先与特定的预杂液进行预杂交，也就是将滤膜的空白处用鱼精 DNA 或牛奶蛋白封闭起来，防止在杂交过程中滤膜本身对探针的吸附。杂交在一定的溶液条件和
14、温度下，将标记的核酸探针与滤膜混合，如果滤膜上的 DNA 分子存在与探针同源的序列，那么探针将与该分子形成杂合双链，从而吸附在滤膜上。洗膜经过一定的洗涤程序将游离的探针分子除去。,3检测放射性标记、检测在分子克隆操作中用于标记核酸分子的标记物主要是放射性同位素，如32P，33P和35S 放射性的信号通过X-光片放射自显影或磷屏扫描获取。,非放射性标记、检测其中应用最成功的是地高辛（digoxygenin,DIG）标记核酸探针。将 DIG 与 dUTP 交联，在参入核苷酸的标记反应中用 DIG-11-dUTP（或 DIG-11-UTP）取代 dTTP（或 rTTP），使探针 DNA 或 RNA
15、分子被 DIG 标记将抗 DIG 的抗体与碱性磷酸酶偶联，通过免疫反应将碱性磷酸酶携带到目标核酸分子处在加入显色剂 BCIP/NBT（5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐/盐酸氮蓝四唑）后碱性磷酸酶与显色剂反应形成浓紫色偏棕色沉淀，从而显示出目标分子的有无和位置,M，地高辛（DIG）标记的分子量标准（lDNA/Hind）；1-3，苏云金芽胞杆菌 YBT-1520 菌株的总 DNA 分别经 KpnPst、Pst 和 Kpn 酶切。以 cry1Aa 杀虫晶体蛋白基因中的 728bp 片段作探针，通过随机引物标记的方式，用 DIG 标记探针。结果显示，该菌株至少含有两个杀虫晶体蛋白基因，而且其拷贝数明显不
16、同。预示至少其中一个基因位于多拷贝的质粒上。,二、Northern杂交,RNA杂交探针为 DNA 或 cDNA,Northern 杂交的总体过程与 Southern 杂交相似，只不过在 Blotting 过程中转移的是 RNA 而不是 DNA 设计者为之起了一个与 Southern blotting 对应的名称 Northern blotting Northern 杂交主要用来检测细胞或组织样品中是否存在与探针同源的 mRNA 分子，从而判断在转录水平上某基因是否表达，在有合适对照的情况下，通过杂交信号的强弱可比较基因表达的强弱。,三、Western杂交,蛋白质的免疫分析探针为抗体,Weste
17、rn 杂交的总体过程与 Southern 杂交相似通过抗体以免疫反应形式检测滤膜上是否存在被抗体识别的蛋白质，并判断其分子量。所用的探针不是 DNA 或 RNA，而是针对某一蛋白质制备的特异性抗体。Western 杂交主要用来检测细胞或组织样品中是否存在能被某抗体识别的蛋白质，从而判断在翻译水平上某基因是否表达。这种检测方法与其它免疫学方法的不同是可以检测出目标蛋白质的分子量,四、其他分子杂交,1 原位杂交(in situ hybridization)i.原位菌落杂交ii.原位噬菌斑杂交iii.原位细胞杂交iv.原位组织块杂交原位裂解细胞，不需要分离DNA，RNA或蛋白质样品，可同时处理大量样
18、品，常用于目的基因的筛选或检测某类细胞或组织中是否存在某一特定的DNA、RNA或蛋白质序列。,1）原位杂交样品膜的制备 i.原位菌落杂交样品膜,a 细胞培养（高密度，几百十万个菌落或低密度，几百个以下）b 细菌细胞原位裂解与DNA变性 ii.原位噬菌斑杂交样品膜 a 细胞感染和噬菌斑形成（10,000-20,000/平板）b 噬菌体转移用NCF作影印 c DNA变性与固定（与上同）,2 斑点杂交(dot hybridization)先分离DNA，RNA或蛋白质，然后将样品液直接点在固体基质上进行杂交，不能测定分子量大小。,3.狭线杂交将已知含量的RNA样品通过带有固定尺寸狭缝的装置固定在滤膜上
19、，在滤膜上形成的条斑面积一样，可以通过杂交信号的强度判断样品中RNA含量的高低。可以比较目的基因的表达强度,五、探针的标记,1.均匀标记间接标记不是标记探针分子本身，而是复制一段新的探针分子，在复制过程中掺入标记的核苷酸（如-32 PdATP），从而使整个新分子被均匀地标记。,（1）切口移位法 ds-DNA+DNase I+DNApol I+dNTP(32P-dCTP)（2）随机DNA引物延伸法 ds-DNAss-DNA-(6n,t)Klenow片段+dNTP(32P)（3）PCR扩增标记在PCR扩增时加入标记的 dNTP，不仅能对探针 DNA 进行标记还可进行大量扩增，尤其适合于探针 DNA
20、 浓度很低的情形,（4）单链探针i 单链DNA探针单链 DNA 探针通过单链模板来制备的首先将待标记的双链 DNA 连接到 M13 噬菌体载体或噬菌粒载体上，制备其单链 DNA然后以单链 DNA 为模板，以对应于载体上插入位点两端序列之一的通用引物为引物，在有标记的 dNTP 存在下，通过 Klenow DNA 聚合酶合成单链 DNA经过分离纯化后即可得到高质量的带标记的单链 DNA 探针,ii 单链RNA探针有些质粒载体的多克隆位点两端带有噬菌体的启动子，例如 T7/T3 噬菌体启动子。将待标记的 DNA 片段插入载体的多克隆位点，在转录区下游选择一个酶切位点，用限制性内切酶将载体线性化以防
21、止转录出载体的序列和多联体产物。加入对应的噬菌体 RNA 聚合酶，rNTP 和某个标记的 rNTP 在体外进行转录，合成出标记的单链 RNA。利用无 RNA 酶活性的 DNA 酶处理以及后续纯化步骤可获得纯化的单链 RNA 探针。单链 RNA 探针的制备不仅比单链 DNA 探针更容易，而且其产生的杂交信号更强。,2.末端标记i.5-末端标记ss-和ds-DNA,RNA脱磷酸化反应(CIP)T4DNA激酶(-32P)ATPii.3-末端标记 i)TdT加尾反应，用于dsDNAii)补齐反应,iii)T4 RNA连接酶反应 RNA-OH+*pNp（3-5-二磷酸核苷）+ATPRNA-*pNPp+pA+ppi,3.标记物及其检测见前,
