实验三酵母核糖核酸(RNA)的提取.ppt

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1、实验三 酵母菌RNA的提取、鉴定及定量测定,一、实验目的,掌握稀碱(NaOH)法分离酵母RNA的原理与方法了解RNA的组分并掌握定性鉴定的具体方法。,二、实验原理,(一)目前常用的RNA的制备方法浓盐法:是用高浓度盐溶液处理,同时加热,以改变细胞壁的通透性,使核酸从细胞内释放出来。成本低、适于大规模操作。稀碱法:是用氢氧化钠使酵母细胞壁变性、裂解,然后用酸中和,除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀RNA。提取的RNA有不同程度的降解。稀碱法的提取时间短,提取率高于浓盐法,更利于工业化生产。,(二)实验材料的选择,酵母细胞富含核酸,且核酸主要是RNA,含量为干菌体的2.67%-10.0%,而DN

2、A含量较少,仅为0.03%-0.516%。为此提取RNA多以酵母为原料。,(三)RNA的化学组成的鉴定,(1)嘌呤碱鉴定:与硝酸银作用产生白色的嘌呤银化合物沉淀。(2)核糖的鉴定:地衣酚(3,5二羟甲苯试剂)显色法(3)磷酸的鉴定:与钼酸铵试剂作用产生黄色的磷钼酸铵沉淀(NH4)3PO412MoO3。(4)脱氧核糖的鉴定:与二苯胺试剂反应生成蓝灰色沉淀,如没有沉淀产生,说明没有DNA.,三、试剂,1.干酵母粉。20.04mol氢氧化钠溶液。3乙酸。495乙醇。55硫酸。6.浓氨水。7.50g/L硝酸银溶液。,8地衣酚(3,5二羟甲苯试剂):取比重1.19HCl 100ml,加入FeCl36H2

3、0 100mg及二羟甲苯100mg,混匀溶解后,置于棕色瓶中,此试剂必须在临用前新鲜配制。市售的3,5二羟甲苯不能使用,必须用苯纯化结晶l2次,并用活性炭脱色方可使用。9定磷试剂:2.5钼酸铵溶液:20ml水溶解2.5克钼酸铵,加5molL H2S0430ml,用水稀释至l00ml,此试剂可在冷处保存一月不变质。,10.10抗坏血酸(Vc)溶液:10g抗坏血酸溶于100ml水。贮棕色瓶中。溶液呈淡黄色尚可用,如呈深黄色即失效。11二苯胺试剂:称取1.5g二苯胺(如不纯,须在70乙醇中重结晶2次),溶于100ml冰醋酸(AR)中,再加入浓H2SO41.5ml,摇匀,贮在棕色瓶中放冰箱内保存备用。

4、12沉淀剂(钼酸铵过氯酸试剂):0.25钼酸铵溶于2.5过氯酸中。如配200ml,即在 193ml水中加入7m170过氯酸和0.5g钼酸铵。,四、操作步骤,1.核酸的提取:每二人用大试管取1g干酵母,加入0.05mol NaOH溶液5ml提取,放入试管沸水浴加热30分钟,并经常搅拌。待冷却后加入乙酸58滴,使提取液呈酸性(石蕊试纸),移在离心管里,离心10分钟(3500转分)。将上清液倒入另一离心管中,加入95乙醇2ml,边加边搅。加毕,离心10分钟,即可得到核酸钠的白色沉淀。,2.核酸的水解:在含有核酸钠的离心管中加入5硫酸2ml,用玻棒搅匀,沸水浴煮10分钟。其中1ml水解液放进EP管里,

5、贴好标签冷冻保存(下次试验用),3.核酸的鉴定 取水解液,按下表所列程序分别鉴定核酸的嘌呤碱、磷酸及核糖和脱氧核糖。,1.嘌呤碱的鉴定:取试管两只,分别标明测定管与对照管,依次加入下列各试剂。,注:加浓氨水使呈碱性可用pH 试纸检定。加入AgNO3后,观察有何变化。静置15分钟后,再比较两管中之沉淀。,2.磷酸的鉴定:取试管两只,分别标明测定管与对照管,然后依次加入下列各试剂:,放置数分钟,观察两管颜色有何不同。磷酸+钼酸铵磷钼酸+Vc钼蓝,3.核糖的鉴定:取试管两只,分别标明测定管与对照管,然后依次加入下列各试剂。,将两试管放入沸水浴内加热10分钟,比较两管之颜色。,4.脱氧核糖的鉴定:取两

6、试管分别标明测定管与对照管,然后依次加入下列各试剂。,将两试管同时放入沸水浴内,加热10分钟后,比较两管之颜色。,思考题,1.核酸的溶解性质是什么?常用什么试剂分离沉淀核酸?2.为什么用酵母作为实验原料?如何使RNA从酵母中释放出来?3.破酵母细胞时为什么要在沸水浴中进行?,实验五 RNA的定量测定紫外(UV)吸收法,一、目的要求,1.掌握紫外线(UV)吸收法测定核酸浓度的原理。2.熟悉紫外分光光度计的使用方法。,二、实验原理,核酸及其衍生物,核苷酸、核苷、嘌呤和嘧啶有吸收UV的性质,其吸收高峰在260nm波长处。测得未知浓度核酸溶液的A260nm值,即可以计算出其中RNA或DNA的含量。该法

7、操作简便,迅速,并对被测样品无损,用量也少。,三、试剂,钼酸铵过氯酸沉淀剂:取3.6ml 70%过氯酸和0.25g钼酸铵溶于96.4ml蒸馏水中,即成0.25%钼酸铵2.5%过氯酸溶液。,四、操作步骤,(1)取0.5ml未知浓度的RNA溶液(上次实验提取),用蒸馏水稀释至50ml,此为A液。(2)取A液2ml,再稀释至50ml,为B液。(3)另取4ml A液,加1ml沉淀剂,摇匀后置冰水中20分钟,离心(3500rpm/min,10分钟),取上清液2.5ml,稀释至50ml,此为C液。沉淀剂的作用是,使RNA沉淀析出,得到不含RNA的对照液。(4)分别取B,C液于厚度为1cm的石英比色杯,在2

8、60nm波长处测定A值。,式中A260为B管稀释液在260nm波长处A值减去C管稀释液在260nm波长处A值。N为稀释倍数.0.024(或0.020)表示1mg/ml RNA(或DNA)溶液测定的A260值相当于0.024。此为多次试验验证的数值。,计算,1000,思考题,1.核酸的溶解性质是什么?常用什么试剂分离沉淀核酸?2.为什么用酵母作为实验原料?如何使RNA从酵母中释放出来?3.破酵母细胞时为什么要在沸水浴中进行?,实验六 过氧化氢酶米氏常数(Km)的测定,一、实验目的,学习米氏常数的测定方法。,二、实验原理米氏常数的测定,米氏常数的测定:双倒数作图法(Lineweaver-Burk法

9、),1 Km 1 1=.+v Vmax S Vmax,二、实验原理,本实验测定红细胞中过氧化氢酶的米氏常数。过氧化氢酶(CAT)催化下列反应:2H2O2 CAT 2H2O+O2 H2O2浓度可用KMnO4在硫酸存在下滴定测知。2KMnO45H2O23H2SO4-2MnSO4K2SO45O28H2O 求出反应前后H2O2的浓度差即为反应速度。作图求出过氧化氢酶的米氏常数。,三、试剂,10.05mol/L草酸钠标准液 将草酸钠(AR)于100105烘12h。冷却后,准确称取0.67g,用水溶解倒入100ml量瓶中,加入浓H2SO4 5ml,加蒸馏水至刻度,充分混匀,此液可贮存数周。2约0.02ml

10、 KMnO4储存液 称取KMnO4 3.5g,溶于1000ml蒸馏水中,加热搅拌,待全部溶解后,用表面皿盖住,在低于沸点温度上加热数小时,冷后放置过夜,玻璃丝过滤,棕色瓶内保存。30.004mol/L KMnO4应用液 取0.05mol/L草酸钠标准液20ml,于锥形瓶中,加浓H2SO4 4ml,于70水浴中用KMnO4贮存液滴定至微红色,根据滴定结果算出KMnO4贮存液的标准浓度,稀释成0.004mol/L,每次稀释都必须重新标定储存液。4约0.08mol/L H2O2液 取20%H2O2(AR)40ml于1000.0ml量瓶中,加蒸馏水至刻度,临用时用0.004mol/L KMnO4标定之

11、,稀释至所需浓度。50.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)。,四、操作步骤,l血液稀释:吸取新鲜(或肝素抗凝)血液0.1ml,用蒸馏水稀释至10ml,混匀。取此稀释血液1.0ml,用磷酸盐缓冲液(pH7.0,0.2mol/L)稀释至10ml,得1:1000稀释血液。2H2O2浓度的标定:取洁净锥形瓶两只,加浓度约为0.08mol/L的H2O2 2.0ml和25%H2SO4 2.0ml,分别用0.004mol/L KMnO4滴定至微红色。从滴定用去KMnO4 ml数,求出H2O2的 mol浓度。,3反应速度的测定:取干燥洁净50ml锥形瓶5只,编号,按下表操作。将各瓶置37水浴预热5min,

12、依次加入1:1000稀释血液每瓶0.5ml,边加边摇,继续保温准5min,按顺序向各瓶加25%H2SO4 2.0ml,边加边摇,使酶促反应立即终止。最后用0.004mol/L KMnO4滴定各瓶至微红色,记录KMnO4消耗量(ml)。,五、计算,1(式中:4为反应液量4ml)2反应速度的计算:以反应消耗的H2O2 mmol数表示。反应速度=加入的H2O2 mmol数剩余的H2O2 mmol数剩余的H2O2 mmol数:KMnO4 0.005 mol/L消耗的KMnO4毫升数 5/2(式中:5/2为KMnO4与H2O2反应中mol换算系数)3求Km值:实验测得的结果,以1/v对1/S作图,求出V

13、和Km的数值。,0.004,实验七 维生素C的定量测定 2.6-DCPIP(2.6-二氯酚靛酚)滴定法,一、实验目的,1.学习并掌握定量测量维生素C的原理和方法。2.熟练微量滴定法的基本操作。,二、实验原理,维生素C是人类营养中最重要的维生素之一,根据它具有的还原性质可以测定维生素C的含量。常用的测定方法有(1)2,6-DCPIP(Dichlorophenolindo phenol)(还原型VC)(2)2,4-二硝基苯肼法(总VC)(3)碘酸法(4)碘量法(5)荧光分光光度法,三、试剂及仪器,(一)试剂及材料(1)松针(2)酸化蒸馏水(3)2,6DCPIP;将50mg2,6DCPIP溶解于约2

14、00ml含有52mg碳酸氢钠的热水中。冷后稀释至250ml。装入棕色瓶内。放在 冰箱里保存。2,6DCPIP不稳定,每周必须重新配制,使用前需按照下法标定:取5ml标准抗坏血酸溶液加5ml1草酸,以2,6DCPIP滴定呈粉红色,并在15秒钟内不退色为终点。计算2,6DCPIP溶液的浓度。(4)标准抗坏血酸溶液:溶解100mg纯抗坏血酸粉状结晶于1草酸中,然后稀释到500ml。使用前临时配制。(二)器材(1)锥形瓶(50ml)(2)小研钵(3)吸量管(10ml)(4)漏斗(5)滤纸(6)容量瓶(50ml)(7)微量滴定管(5ml),四、操作步骤,1.准确称取松针约1g。样品必须用温水洗去泥土,并

15、在空气中风干。放入研钵中,加1g石英砂,再加酸化蒸馏水510ml一起研磨。2.离心(3500转/分)10分钟,将上清液移入容量瓶,用酸化蒸馏水定容至50ml。3.取10ml上述溶液放入小锥形瓶内,用微量滴定管,以2,6DCPIP(蓝色)滴定至提取液呈现淡粉红色,并保持1530秒不褪。(滴定过程必须迅速,不要超过2min。因为在本滴定条件下,一些非维生素C还原物质的还原作用较迟缓,快速滴定右以避免或减少它们的影响)4.另取10ml酸化蒸馏水作空白对照滴定。提取液和空白对照各做三份,对结果取平均值进行计算,五、计算,式中:VA为滴定样品提取液所耗用的2,6DCPIP的平均毫升数;VB为滴定空白对照

16、所耗用的2,6DCPIP的平均毫升数;C为样品提取液的总毫升数;D为滴定时所取的样品提取液毫升数;W为被检样品的质量。T为1ml标准0.001N 2,6DCPIP溶液相当维生素C的毫克数,T的具体数目为0.088mg/ml。,思考题为了准确测得维生素C含量,实验过程中都应注意哪些操作步骤?为什么?,实验八 血糖的定量测定(GOD-PAP法),一、实验目的,学习GOD-PAP法测定血糖含量的原理和方法。,二、实验原理,动物血液中的糖主要是葡萄糖,正常情况下,其含量较恒定。健康动物血糖水平为80-120mg/100ml。GOD-PAP法,即过氧化物酶-抗过氧化物酶法是近几年临床血糖定量测定的普遍方

17、法。该法测定血糖依据的酶反应为:葡萄糖+O2+H2O=葡萄糖酸+H2O2 2H2O2+4-氨基安替比林+酚=醌亚胺+4H2O醌亚胺在A480nm-A550nm波长有最大吸收,所产生颜色的深浅与血清中葡萄糖的量成正比。在同样条件下,测定葡萄糖标准液和样品的吸收值,代入后面所给公式即可求出样品中葡萄糖的含量。,三、试剂及仪器,1.血糖试剂盒 酶试剂(GOD,PAP,磷酸盐,酚,4-氨基安替比林)100mg/dL血糖标准溶液 2.兔血清,四、操作步骤,取3只试管,按下列加入试剂 空白 标准 样品酶制剂 3.00ml 3.00ml 3.00ml蒸馏水 0.02ml-葡萄糖标准溶液-0.02ml-样品-

18、0.02ml分别将各管溶液摇匀,37度保温15分钟,505nm波长比色。,五、计算,C样品=(A样品/A标准)x C标准,实验九 小麦萌发前后淀粉酶活力的比较,一、实验目的,1学习分光光度计的原理和使用方法。2学习测定淀粉酶活力的方法。3了解小麦萌发前后淀粉酶活力的变化。,二、实验原理,种子中贮藏的碳水化合物主要以淀粉的形式存在。种子萌发时,淀粉酶活性随萌发时间迅速增加,将淀粉分解成小分子糖类,供幼苗生长。淀粉的水解产物麦芽糖有还原性,能与3,5-二硝基水杨酸试剂反应,使其还原生成红色3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内,其颜色深浅与淀粉酶水解产物的浓度成正比,可用麦芽糖(或葡萄糖)浓度表示

19、,用比色法测定淀粉生成的还原糖的量,以单位重量样品在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力。,三、试剂及仪器,(一)器材125毫升刻度试管。2吸管。3乳体。4离心管。5分光光度计。6离心机。7恒温水浴。(二)试剂1.0.1标准麦芽糖溶液 20毫升:精确称量100毫克麦芽糖,用少量水溶解后,移入100ml容量瓶中,加蒸馏水至刻度。2pH 6.9,0.02摩尔L磷酸缓冲液 100毫升3l淀粉溶液100毫升:1克可溶性淀粉溶于100毫升 0.02摩尔L磷酸缓冲液,其中含有 0.006摩尔L氯化钠。4l3,5-二硝基水杨酸试剂:1g 3,5-二硝基水杨酸溶于20毫升2摩尔L的氢氧化钠溶液和50毫升水中;

20、再加人30克酒石酸钾钠,定客至100毫升。若溶液混浊,可过滤。5l氯化钠溶液300毫升,四、操作步骤,1种子发芽:小麦种子浸泡2.5小时后,放人25恒温箱内或在室温下发芽。2酶液提取:取发芽第三天或第四天的幼苗15株,放人乳钵内,加海砂 0.2g,加 1NaCI溶液10毫升,用力磨碎。在室温下放置 20分钟,搅拌几次。将提取液离心(l500转min)10分钟。将上清液倒人量筒,测定酶提取液的总体积。进行酶活力测定时,将酶提取液稀释10倍。取干燥种子15粒作为对照(提取步骤同上)。,四、操作步骤,3酶活力测定:(1)取25毫升刻度试管4支。编号。按下表要求加人各试剂(各试剂须25预热10分钟)。将各管混匀,放在25,水浴中保温3分钟后,立即向各管中加人13,5-二硝基水杨酸溶液2毫升。(2)取出各试管,放人沸水浴中加热5分钟。冷至室温,加水稀释至25毫升。将各管充分混匀。(3)用空白管作对照;在500nm处测定各管的光吸收值.,五、计算,根据溶液的浓度与光吸收值成正比的关系,即:A标准A未知C标准C未知则 CA酶C标准A标准总活力单位=C酶N酶V酶N为酶液的稀释倍数V为测量后酶液的总体,

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