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1、实验二 总氮量的测定凯氏定氮法,一 目的：学习凯氏定氮法测定蛋白质含量的原理和操作技术二 原理：通过含氮有机物与浓硫酸共热生成硫酸铵，后与浓碱反应产生氨经硼酸吸收后用标准无机 酸滴定即可测出待测物中的总氮量三 试剂：浓硫酸（化学纯）、粉末硫酸钾硫酸铜混合物、NaOH、硼酸、盐酸、田氏指示剂（甲烯蓝乙醇与甲基红乙醇混合）、面粉四 器材：凯氏定氮烧瓶、凯氏定氮蒸馏装置、50ml容量瓶、3ml微量滴定管、分析天平、烘箱、电炉、100ml蒸馏烧瓶、小玻璃珠五 操作步骤六 实验报告,二、原理,生物材料的含氮量测定在生物化学研究中具有一定的意义，蛋白质的含氮量约为16，测出含氮量则可推知蛋白含量。消化：有
2、机物与浓硫酸供热，使有机氮全部转化为无机氮硫酸铵。为加快反应，添加硫酸铜和硫酸钾的混合物；前者为催化剂，后者可提高硫酸沸点。甘氨酸的消化过程可表示如下：CH2NH2COOH+3H2SO4 2CO2+3SO2十4H2O十NH3 2NH3+H2SO4(NH4)2SO4 浓碱可使消化液中的硫酸铵分解，游离出氨，借水蒸汽将产生的氨蒸馏到一定量、一定浓度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后使溶液中的氢离子浓度降低，然后用标准无机酸滴定，直至恢复溶液中原来的氢离子浓度为止，最后根据所用标准酸的摩尔数(相当于待测物中氨的摩尔数)计算出待测物中的总氮量。本法适用于0.2 2.0 mg的氮量测定。,三、试剂,1、浓硫酸
3、200mL 2、粉末硫酸钾硫酸铜混合物 16g K2S04与CuS04.5H20以 3：1配比研磨混合3、30氢氧化钠溶液 1 000 mL 4、2硼酸溶液 5 000 mL5、标准盐酸溶液(约001 molL)6、混合指示剂(田氏指示剂)由50mL01甲烯蓝乙醇溶液与200mL01甲基红乙l醇溶液混合配成，贮于棕色瓶中备用。这种指示剂酸性时为紫红色，碱性时为绿色。变色范围很窄且灵敏。7、市售标准面粉和富强粉各2g,五、操作方法,1.样品处理 原因:某一固体样品中的含氮量是用100g该物质(干重)中所含氮的g数来表示()。方法:一般样品烘干的温度都采用105，因为非游离的水都不能在100以下烘
4、干。在称量瓶中称一定量磨细的样品(如0.1 g左右的干燥面粉)，然后置于105的烘箱内干燥4小时。用坩埚钳将称量瓶放人干燥器内，待降至室温后称重，按上述操作继续烘干样品。每干燥1小时后，称重一次，直到两次称量数值不变，即达恒重。若样品为液体(如血清等)，可取一定体积样品直接消化测定。,2消化,取4个100mL凯氏烧瓶 标号。各加l颗玻璃珠，在1及2号瓶中各加样品0.1g，催化剂(K2S04CuS04?5H2O)200 mg，消化液5 mL。在3及4号瓶中各加0，1 mL蒸馏水和与1及2号瓶相同量的催化剂和浓硫酸，作为对照，用以测定试剂中可能含有的微量含氮物质。每个瓶口放漏斗，在通风橱内的电炉上
5、消化。注意加样品时应直接送人瓶底，而不要沾在瓶口和瓶颈上。当消化开始时应控制火力，不要使液体冲到瓶颈。待瓶内水汽蒸完，硫酸开始分解并放出SO2白烟后，适当加强火力，继续消化，直至消化液呈透明淡绿色为止。定容：冷却后，加蒸馏水约10 mL。(注意慢加，随加随摇)。然后将瓶中溶物倾人50 mL的容量瓶中，并以蒸馏水洗烧瓶数次，将洗液并容量瓶，用水稀释到刻度，混匀备用。,改进型凯氏定氮仪结构,特点：将蒸汽发生器、蒸馏器和冷凝器组成一个整体，体积小，安装容易，操作简便。(1)水蒸汽发生器和反应室(2)冷凝器和通气室(3)排水柱关键:搞清水管系统,蒸馏器的洗涤,接通冷凝水，先向蒸汽发生器中加入一定量的水
6、(先关闭进水口,再关闭出水口,以排水口高度为宜),用酒精灯将其加热烧开。水的自动喷出：将蒸馏水由加样室加入反应室，将酒精灯移开片刻，打开自由夹，使冷水进入蒸汽发生器，如此反复清洗3-5次。清洗后在冷凝管下端放一锥形瓶盛有5 mL，2硼酸溶液和12滴指示剂的混合液。如不变色则表明蒸馏装置内部已洗涤干净。,3蒸馏过程：,准备:取50 mL锥形瓶数个，各加入5 mL 2硼 酸溶液和12滴指示剂，溶液呈淡紫色，用表面皿覆盖备用。关闭冷凝水，打开自由夹，使蒸汽发生器与大气相通。将一个盛有硼酸和指示剂溶液的锥形瓶放在冷凝器下，并使冷凝器下端浸没在液体内。加样:用移液管取5 mL消化液，细心地加入反应室，随
7、后加入30NaOH溶液5mL，关闭自由夹，在加样漏斗中加少量水做水封。蒸馏:关闭自由夹,打开冷凝水(注意不要过快过猛，以免水溢出)。点燃酒精灯,蒸馏开始,当观察到锥形瓶中的溶液由紫变绿时(约23分钟)，开始计时，蒸馏3分钟，移开锥形瓶，使冷凝器下端离开液面约1cm，同时用少量蒸馏水洗涤冷凝管口外侧，继续蒸馏1分钟，取下锥形瓶，用表面皿覆盖瓶口。蒸馏完毕后，应立即清洗反应室，方法如前所述。如此35次。最后将自由夹同时打开，将蒸汽发生器内的全部废水换掉，继续下一次蒸馏。待样品和空白消化液均蒸馏完毕，同时进行滴定。,4.滴定,全部蒸馏完毕后，用标准盐酸溶液滴定各锥形瓶中收集的氨量，硼酸指示剂溶液由绿变淡紫色为滴定终点。,5.计算,总氮量=C(V1-V2)0.014/w 消化液量(ml)/滴定消耗用液量(ml)c为标准盐酸溶液摩尔浓度；V1为滴定样品用去的盐酸溶液平均mL数；V2为滴定空白消化液用去的盐酸溶液平均mL数w为样品重量(g)。14为氮的相对量子质量。若测定的样品含氮部分只是蛋白质，则，样品中蛋白质含量()二总氮量625,思考题,1、何谓消化？如何判断消化终点？2、在实验中加入粉末硫酸钾硫酸铜混合物的作用是什么？3、固体样品为什么要烘干？4、蒸馏时冷凝管下端为什么要浸没在液体中？5、如何证明蒸馏器洗涤干净？6、本实验应如何避免误差？,
