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1、实验室检测技术培训2012-8-31,准备 陈腾飞,目 录,一、细菌对生产的危害及药敏试验二、血清学检测技术在生产中的应用三、活苗病毒含量的测定（EID50）及无菌检验四、灭活苗稳定性和粘度实验五、饲料理化检测技术,一、细菌对生产的危害及药敏试验,认识微生物：微生物是一切肉眼看不见或看不清的微小生物。具有个体小，种类多，繁殖速度快，分布广泛，活性强，易变异的特点。细菌，病毒，真菌，放线菌，螺旋体，立克次氏体，支原体，衣原体 细菌：一类细胞细短，结构简单，胞壁坚韧，多以二分裂方式繁殖和水生性强的原核生物。生长条件：水，营养物质（代谢和合成所需的元素），能量（温度）等 菌落:单个细菌用肉眼是看不见
2、的，当单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，便会形成一个 肉眼可见的，具有一定形态结构的子细胞群落。目前理化中心对生产场区进行的微生物检测包括：水质的细菌总数及大肠菌群；空气细菌总数；泄殖腔（竹排）沙门氏菌；饲料的细菌总数、大肠、霉菌及沙门；空舍的细菌总数及孵化厂上孵、落盘微生物；雏鸡沙门等。分为四大类：细菌总数、大肠菌群、沙门氏菌、霉菌总数，以后将要关注的有绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、巴氏杆菌等,1.1 水质管理对家禽生产性能的影响,水是最关键的营养物质，家禽的摄水量几乎是采食量的2倍在家禽代谢中的作用：体温调节 食物的消化 废物的排泄水是家禽有效生产的最基本因素,水中微生物能够影响肠道内的
3、微生物菌群肠道微生物菌群的作用：.维护肠道健康.抵制疾病.生产性能和效益.利润率.食品安全影响水质的重要因素：细菌和其他微生物 矿物质 pH值 水线卫生状况 水质监测目前我们所检测的细菌总数的含量标准cfu100/ml；大肠1/ml,保证最优水质的步骤：第一步：检测 测定水中的细菌数量（总细菌数和大肠菌）；测定水的pH值；测定水的硬度；测定水中矿物质含量我们每个车间都应做的工作 有效控制微生物的含量1、氯化处理2、使用碘液消毒3、臭氧消毒4、过氧化氢消毒5、酸化处理,清洁,改良处理,1.2大肠菌群及沙门对家禽的影响,所谓总大肠菌群系指一群在37培养24小时能发酵乳酸、产酸产气、需氧和兼性厌氧的
4、革兰氏阴性无芽胞杆菌。大肠菌群分布较广，在温血动物粪便和自然界广泛存在-条件性致病菌大肠杆菌（escherichia coli）一般不致病。但致病性大肠菌株能引起食物中毒。致病性菌株能侵入肠粘膜上皮细胞，具有痢疾杆菌样致病力：如腹膜炎、坏死性肠炎等。,革兰氏阳性菌,革兰氏阴性菌,沙门氏菌对种鸡场的危害,家禽沙门氏菌感染可以分为两种类型：一种是直接危害家禽健康的沙门氏菌感染（雏鸡白痢沙门氏菌和鸡伤寒沙门氏菌），另一种是危害人类健康的沙门氏菌感染，即副伤寒沙门氏菌，如：肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌。肠道中的沙门氏菌即可经肠系膜淋巴结和淋巴组织进入血液引起全身感染，甚至死亡。如鸡白痢沙门氏菌，主要侵
5、害雏鸡，引起败血症，可造成大批死忙。在成年母鸡则主要引起卵巢炎，可在卵黄内带菌而传给幼雏。,造成经济和声誉的双重损失,沙门氏菌不易控制的主要原因,检测方法局限,分离鉴定ELISAPCR卵黄抗体检测平板凝集试验,经济实用的检测法：全血平板凝集检测法,种鸡场沙门氏菌常见控制方法,1.3 药敏试验,抑菌圈：抗菌药物纸片在其周围因抑制细菌生长而出现的无菌生长区域。选择原则应考虑到药物临床疗效、耐药菌株流行情况、预防耐药菌株产生和经济的综合因素，最终目的是达到控制感染用无菌镊子夹取待检组织均匀涂布于麦糠凯培养基表面。用无菌镊子夹取制备好的各种药敏纸片，分别贴到培养基表面，并用镊子轻压纸片，使药敏纸片与培
6、养基表面贴紧。为了能准确观察结果，要求药敏纸片均匀分布于培养基表面，位置安排适中，防止出现抑菌圈重叠现象。一般可在平皿中央贴一片，外周等距离贴6片。对于自制药敏试纸，在每贴一种试纸后，应在平板底部做好标记或贴上标签。将贴好药敏试纸的平板置于4冰箱中15min，使药物充分扩散后,再将平板底部在下，置361培养箱中培养1824h。结果观察用直尺测量抑菌圈直径的大小，以 mm为单位。13低敏；14-17中敏；18高敏,二、血清学检测技术在生产中的应用,1、常规检测：平板凝集试验、琼脂扩散试验（AGP)、血凝试验（HA）、血凝抑制试验（HI）。2、酶联免疫吸附试验（ELISA)。,用疫苗按一定免疫程序
7、进行免疫接种是控制鸡病流行的主要途径之一，但鸡群免疫抗体的产生及维持时间受到鸡群免疫应答能力、所用疫苗种类、免疫方法、免疫次数、疫病流行状况等方面的影响，良好的免疫接种不等于鸡群能够产生良好的保护力。因而通过对鸡群进行抗体监测，及时检查鸡群的免疫状态、疫苗使用效果，为制定合理的免疫程序提供依据就显得非常重要。因此，建立开展免疫抗体监测工作，成为我们养鸡生产中的一项重要工作。下面将抗体监测所需设备及检测项目、监测过程向大家做一说明。,血清学检测项目：,定义 血凝（HA）：某些病素或病毒的血凝素，能选择性地使某种或某几种动物的红细胞发生凝集，这种凝集红细胞的现象称为血凝，也称直接血凝反应。血凝抑制
8、（HI）：当病毒的悬液中先加入特异性抗体，且这种抗体的量足以抑制病毒颗粒或其血凝素时，则红细胞的表面的受体就不能与病毒颗粒或其血凝素直接接触，这时红细胞的凝集现象被抑制，称为红细胞凝集抑制反应，也称血凝抑制反应。抗原：凡能刺激机体产生抗体，并能与抗体结合而发生反应的物质成为抗原。,2.1 凝集试验（HA）与凝集抑制试验（HI）,适用范围：适用于对鸡新城疫(ND)，禽流感(AI:H9、H5(H5-4、H5-5)亚型)，鸡减蛋综合症(EDS)抗体滴度的检测。,抗体：是机体受到抗原物质刺激产生的具有特异性的球蛋白，它能与相应的抗原结合，发生各种反应，并具有一定的解除相应病原微生物及其产物的有害作用的
9、能力。抗体和其他免疫球蛋白一样，可被中性盐类沉淀,判定标准：1.ND：育雏育成鸡在6以上，产蛋鸡在8以上2.H5：育雏育成鸡在5以上，产蛋鸡在7以上3.H9：育雏育成鸡在6以上，产蛋鸡在8以上注：在实际生产中，则以实际免疫程序进行分析抗体滴度值的高低。免疫后抗体规律一般活疫苗免后7-10天产生抗体，2-3周抗体到达峰值，可以维持1-2个月灭活疫苗免后10-15天产生抗体，3-4周抗体到达峰值，可以维持3-4个月对H5抗体要求711 log2，低于6log2时及时免疫H9抗体在8-11 log2，当最低抗体为7log2时及时免疫H9单苗ND抗体在8-12 log2产蛋鸡最低值7log2补苗,2.
10、2 ELISA抗体检测操作规程,酶联免疫吸附试验是免疫酶技术应用最广的一种，是继免疫荧光技术和放射免疫技术之后发展起来的又一种免疫酶技术，目前广泛用于多种细菌和病毒等疾病的诊断。ELISA分为竞争ELISA、夹心ELISA、间接ELISA，我们现在检测的主要是间接ELISA。,间接ELISA：一般用于抗体的检测，将已知抗原包被于固相载体上，加入含有特异性抗体的被检血清，再经洗涤后加入酶标二抗，洗涤后加底物，底物分解，出现变色，用酶标仪测出它的吸光值1 原理1.1 使抗原或抗体结合到固相载体表面，并保持其免疫活性。1.2 使抗原或抗体与酶结合成酶标抗原或抗体，并保持抗原或抗体的免疫活性和酶的活性
11、。1.3 酶标的抗原或抗体与相应的抗体或抗原反应后，结合在免疫复合物上的酶催化底物形成水解、氧化或还原反应，形成有色物质，其颜色深浅与标本中抗原或抗体的量直接相关。特点：高度灵敏、特异、快速，定性、定量、定位,注意事项 ELISA试剂盒购回后及时冷藏（38摄氏度）于冰箱中。实验开始前从冰箱中拿出检测板和相应的试剂于室温（2225摄氏度）下进行回温2小时以上，一定要完全回温后才能开始进行实验操作。要认真处理所有的病毒生物材料，以防病毒的传播。不要使TMB溶液暴露在强光或任何氧化剂条件下。在整个操作过程中，滴加和洗涤要仔细。实验时要根据试剂盒的操作说明书来完成。,三、活苗病毒含量的测定（EID50
12、）及无菌检验,活苗病毒含量的测定 鸡胚半数感染剂量（EID50，50%egg infections dose）是指能使50%鸡胚感染的 病毒量。病毒含量的高低直接反映了产品的质量，因此用鸡胚接种测定病毒含量可作为判定产品质量的依据。新城疫弱毒苗无菌检验步骤：冻干疫苗用无菌生理盐水溶解，用T.G（硫乙醇酸盐培养基）培养基50ml，接种新城疫弱毒苗（疫苗做10倍稀释）1ml,置37培养，3天后从瓶中吸培养物，分别接种T.G小管和G.A（酪胨琼脂）斜面各2支，每支0.2ml，一支置于37，一支置于25；取另一支G.P（葡萄糖蛋白胨汤）小管，接种0.2ml置25，均培养7日，应无菌生长。,四、灭活苗稳
13、定性和粘度实验,稳定性检验：1、在37放置一周不分层；2-10放置一年不分层；室温1-2月放置不分层，但允许上部有少许半透明油层，比例不得超过1/20,不破乳，3000rpm,15min,不分层。2、取两块干净的平皿，装上清水放置桌上，待水面稳定后，滴入一滴恢复至常温的油苗，立即扩散，再滴入第二滴成为点状30s-1m内不扩散，说明油苗的油包水较好。粘度检验：用1ml吸管（出口内径为1.2mm），取25左右的疫苗1ml,令其垂直自然流出，记录流出0.4ml所需时间，不超过8s。,五、饲料检测理化技术-检测项目及原理,1.水分1.1原理：试样在1302烘箱内,在大气压下烘干,直至恒重,逸失的重量为
14、水分.1.2快速法（130度，45分钟）1.3步骤：用已知恒重的称样皿称取两份平行试样,每份2-5g(含水重0.1g以上,样品厚度4mm以下)准确至0.0002g,不盖称样皿盖.在1302烘箱中烘45min(温度达到130开始计时),取出,盖好称样皿盖,在干燥器中冷却30min,称重.再同样烘干45min,冷却,称重,直至两次称重之重量差小于0.0002g.1.4要点：称样皿烘至恒重；温度达到130度开始计时；冷却30min开始称重，复烘，再称重；干燥器中的变色硅胶变色时需要烘干；在发生争议的时，以国标中的仲裁法为准。,2.粗灰分 2.1原理：试样在550灼烧后所得残渣,用质量百分率来表示.残
15、渣中主要是氧化物,盐类等矿物质,也包括混入饲料中的沙石,土等,故称为粗灰分.2.2步骤：在已恒重的坩埚中称取2克试样（灰份质量0.05克以上）准确至0.0002克，在电炉上小心炭化，在炭化过程中，应将试样在较低温度状态下加热灼烧至无烟，尔后升温灼烧至样品无炭粒，再放入高温炉，于55020下灼烧3小时，取出，在空气中冷却约1分钟，放入干燥器中冷却至30分钟，称取质量，再同样灼烧1小时，冷却，称重，直至两次质量之差小于0.001克为恒重。2.3要点：在电炉上开始小火烧至无烟，再加大火碳化至无碳粒，再转移到高温炉中灼烧3h，取出后冷却30min,称重，再复烧30min，称重。,3.粗蛋白3.1原理（
16、凯氏定氮法）：在催化剂的作用下，用硫酸破坏有机物，转化成硫酸铵；硫酸铵在强碱的作用下进行蒸馏逸出氨，用硼酸吸收，最后用盐酸滴定，测出氮含量3.2步骤：称取0.3g(含氮量5-80mg)样品,准确至0.0002g.放入消煮管中,加入6.4g混和催化剂,与试样混和均匀,再加入15ml浓硫酸和2粒玻璃珠,将消煮管置于消煮炉上加热,开始小火,待样品焦化,试样变为蓝绿色,加强火力再继续消煮45分钟.将试样消煮液冷却,加入20ml蒸馏水.连接好蒸馏器各接口,关闭排水开关阀门,将带消化液的管子插在蒸馏装置上,以50ml硼酸为吸收液,加入两滴混和指示剂.蒸馏装置的冷凝管末端要浸入装有吸收液的锥形瓶内.打开电源
17、开关,水开关,进入电加热状态.向消煮管中加入50ml氢氧化钠进行蒸馏,蒸馏时间以吸收液体积达到150ml为宜,降下锥形瓶,用蒸馏水冲洗冷凝管末端,取下接收瓶待滴定之用.,2NH2(CH2）2COOH+13 H2SO4（NH4）2 SO4+6 CO2+12 SO2+16 H2（NH4）2 SO4+2NaOH2NH3+3 H2O+2 Na2SO4 4H3 BO3+NH3NH4 H B4O7+5 H2O NH4 H B4O7+HCl+5 H2ONH4Cl+4 H 3BO33.3要点：3.3.1在消化中加入硫酸钾可以提高反应温度加速有机物的分解，一般纯硫酸的沸点为330度，添加硫酸钾可使温度达到400
18、度，但加入的量不宜过多，温度太高会使硫酸铵分解生成硫酸氢氨而使氨逸出，造成结果偏低；3.3.2.硫酸铜也是加速反应的作用；3.3.3.硫酸量也不要加入过多，过多会在蒸馏过程中浪费氢氧化钠，造成整个实验的药品浪费。3.3.4.每次重新配置滴定液时，都要做硫酸铵验证，确保滴定液准确无误,4.钙4.1 原理（EDTA络合滴定法）：将试样中有机物破坏，使钙溶解制备成溶液，用三乙醇胺，乙二胺，盐酸羟胺和淀粉溶液消除干扰离子的影响，在碱性溶液中以钙黄绿素为指示剂，用EDTA标准溶液络合滴定钙，可快速测定钙的含量4.2步骤：称取试样25g（精确至0.0002g）于坩埚中，在电炉上小心炭化，再放入高温炉，在5
19、50灼烧3h（或测灰分后继续进行）取出冷却，加入10ml盐酸和数滴硝酸，小心煮沸约10min，冷却后转入100ml容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，为试样分解液。准确移取试样分解液5ml-25ml(含钙量2mg-25mg),加水50ml,加淀粉溶液10ml、三乙醇胺2ml、乙二胺1ml、1滴孔雀石绿、滴加氢氧化钾溶液至无色,再过量10ml,加0.1g盐酸羟胺(每加一种试剂都须摇匀),加钙黄绿素少许,在黑色背景下立即用EDTA 标准滴定溶液滴定至绿色荧光消失呈现紫红色为滴定终点.同时做空白实验.,4.3 要点：4.3.1.将坩埚中的样品转移到容量瓶的过程中，可提前向坩埚中加入一定量的蒸馏水，降低在
20、转移过程中的损失的相对量；4.3.2.要按照顺序加各种试剂，每加一种必须摇匀；4.3.3.由于EDTA与许多金属离子都可以发生络合反应，加入的三乙醇胺，乙二胺，盐酸羟胺都是掩盖剂，主要掩盖三价铁离子，二价铜离子，二价锰离子，锑离子，三价铝离子等；4.3.4.淀粉主要是作为稀释剂，扩散氢氧化镁等，防止磷酸钙凝集沉淀4.3.5.孔雀石绿为碱性指示剂4.3.6.加氢氧化钾时要一滴一滴加，边加边摇，滴到溶液变为无色，已经把溶液调至PH=7，因孔雀石绿在PH=7时刚好无色，然后再加过量的氢氧化钾使溶液PH达到12碱性条件，在PH12时二价镁离子完全沉淀，也可以消除镁离子的干扰。加入的氢氧化钾也不宜过多，
21、否则一部分钙离子被氢氧化镁吸附，使结果偏低，加入氢氧化钾不足时，镁离子沉淀不完全，使结果偏高4.3.7.加盐酸羟胺后需立即滴定4.3.8.指示剂要保持干燥4.3.9.络合反应需要一定的时间，滴定时速度不宜过快，否则反应不充分，使结果偏高,5.总磷5.1原理（分光光度法）将试样中的有机物破坏,使磷元素游离出来,在酸性溶液中,用钒钼酸铵处理,生成黄色的【(NH4)3PO4 NH4VO316MoO3】络合物,在波长400nm下进行比色测定.5.2步骤：准确称取试样分解液1.010.0ml（含磷量50ug750ug）于50ml容量瓶中，加入钒钼酸铵显色剂10ml，用水稀释至刻度，摇匀，常温下放置10m
22、in以上，用1比色皿在400nm波长下测定试样分解液的吸光度，通过磷标准曲线计算磷含量5.3要点：5.3.1.钒钼酸铵显色剂出现沉淀时不能再使用；5.3.2.重配钒钼酸铵显色剂时要重作磷标准曲线；5.3.3.加完钒钼酸铵显色剂要放置10min再进行测定,6.盐分6.1铬酸钾指示剂法（莫尔法）6.2步骤：称取样品510克准确至0。001克，准确加入蒸馏水200 ml，搅拌15分钟，放置15分钟，准确移取上清液20 ml于三角烧瓶中，加入蒸馏水50 ml，1%铬酸钾指示剂1 ml，用硝酸银标准溶液滴定至呈现砖红色且1分钟不变色为终点。6.3要点：氯化银的溶解度小于铬酸银的溶解度，所以在终点前的沉淀
23、是氯化银，终点时的沉淀是铬酸银，砖红色的现象。7.尿酶活性7.1原理（PH值增值法）：尿素水解产生氨是碱性的，会使PH值升高，试样反应30min与空白溶液的PH差值，可以间接的表示氨含量7.2步骤：称取0.8000g样品于碘量瓶中，加入40ml尿素缓冲溶液，加塞混合，然后置于30度水浴中。空白试验需正确称取0.8000g于碘量瓶中，并加入40ml磷酸盐缓冲液，加塞混合，放置30度水浴中。每隔5min摇匀碘量瓶内容物一次。30min后，将上层的液体移入5ml烧杯中，分别测定此种上层液体的PH值。7.3要点：控制好温度和准确的时间,8.油脂酸价8.1原理（氢氧化钾滴定法）：中和1g游离脂肪酸所需的
24、氢氧化钾的毫克数8.2步骤：称取均匀试样35g（准确至0.0001g)于150ml三角烧瓶中，加入中性乙醇和乙醚混合溶剂50ml，震荡使其溶解，静置510分钟。再加入三滴酚酞指示剂，用0.1N的氢氧化钾标准溶液滴定至出现微红色30秒不褪色即为滴定终点，记录消耗的碱溶液的毫升数（V）。8.3要点：消耗的量很少，滴定速度要慢；乙醚高度易燃，并能生成爆炸性过氧化物，使用时必须特别谨慎；测定深色油酸价时，可适当减少试样量或增加混合溶剂量9.油脂过氧化值9.1原理（硫代硫酸钠滴定法）：油脂中的氧化物与碘化钾反应生成碘，用硫代硫酸钠滴定析出的碘9.2步骤：精确称取23克混匀样品（必要时需过滤）置于250ml碘量瓶中，加入30ml三氯甲烷冰乙酸混合液，溶解样品，加入1。00ml碘化钾饱和溶液，立即加塞摇匀，放置暗处5分钟。取出以上样品，加水100ml，以0。002mol/L硫代硫酸钠标准溶液滴定，至淡黄色时加入1m1%淀粉指示剂，继续滴定到蓝色消失为终点，同时作一空白试验（空白加碘后的放置时间需与被测样品的放置时间相同）9.3要点：碘化钾易分解，现用现配,生物安全,化验室所有实验的器皿、药品、残渣等试验后的废弃物都需经过严格的消毒后才能作为一般垃圾处理。杜绝禁止化验室有害物质的传出！,谢 谢！,
