新药临床前药理毒理学研究(之五).ppt

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1、,新药临床前药理毒理学研究（之五）,袁秉祥西安交通大学医学院药理学系82657724,新药特殊毒性研究,（突变、生殖、致癌、药物依赖试验）,新药临床前特殊毒理学评价包括致突变试验、生殖毒性试验（致畸试验）、致癌试验和药物依赖性试验。,1.突变试验 基本试验方法有三种：1）微生物回复突变试验 即Ames试验，试验用菌株为组胺酸缺陷型鼠伤寒沙门氏菌（S.Typhimurium），以TA97、TA98、TA100和TA102作为标准测试菌株。受试药物至少要设5个剂量组，应设空白、溶媒、阳性对照和代谢活化（S9）对照，实验至少重复一次。结果依据加入被测新药平皿中回变生长的菌落数并与空白对照平皿中的菌落

2、数据相比较得出受试药物有无诱变性来判断。,2）哺乳动物培养细胞染色体畸变试验 用中国仓鼠肺细胞（CHL）在体外培养进行。观察染色体断裂后导致的结构和数目的异常称为染色体畸变。结果要求受试药物诱发的染色体畸变率与对照组比较有统计学意义并与剂量有相关性。3）体内试验 啮齿动物微核（有丝分裂后期）试验，我国新药审批办法中要求做小鼠骨髓微核试验。上述三项致突变试验结果全部阴性时，则不必往下进行。,2生殖毒性试验 1）一般生殖毒性试验（）试验在交配前给药，目的是评价生殖细胞接触药物（化合物）后对受胎能力。实验结果分析和评价包括：受孕率、死胎数、活胎数、活胎重量、性别、外观及内部器官的形态学观察和骨骼的检

3、查。2）致畸敏感期毒性试验（）试验在器官发生期给药，旨在揭示药物可能的胚胎毒性和致畸性。大、小鼠孕后615天，家兔618天连续给药，。妊娠末期剖检。3）围产期毒性试验（）试验在围产期和哺乳期给药，于妊娠后期及整个泌乳期给药，即：大、小鼠于妊娠第15天开始，至分娩后21天（小鼠）和28天（大鼠）；家兔于妊娠第22天开始，至分娩后31天。所有雌性动物自然分娩，观察子代直至成年。,3.致癌试验致癌试验是一项复杂、细致的长期过程，应设空白对照，阳性对照药组（结构相近的已知致癌物），受试药物至少设3个剂量。,4、药物依赖性试验 包括身体依赖性与精神依赖性试验。1）身体依赖性试验 自然戒断试验 需用小鼠、

4、大鼠和猴3种动物，连续给予动物一段时间的受试药后突然停药，观察动物出现的戒断症状。替代试验 给予动物代表药（如吗啡、巴比妥钠或苯巴比妥钠），使之产生身体依赖性后，停止给予代表药，以同样方式给予不同剂量受试药，观察替代期间动物的戒断症状。催促试验 短时间内给予动物大剂量受试药，然后注射受体拮抗剂（钠洛酮）以催瘾，观察是否出现戒断症状及其程度。诱导试验 诱发惊厥，包括：听源性发作（Audiogenic seizures）；戊四氮惊厥（Pentylenetetrazole）。对镇静催眠药产生身体依赖性的动物，在断药期间出现反跳性兴奋，用阈下刺激强度诱发惊厥。,2）精神依赖性试验 采用“自身给药”（觅

5、药行为）操作式条件行为试验，测定静脉注射药物对动物的强化效应，是当前国际上通用的评价药物精神依赖性潜力实验方法。,新药临床前药理毒理学研究（之六）,袁秉祥西安交通大学医学院药理学系82657724,新药制剂安全性试验,（过敏、刺激、溶血试验）,制剂安全性（刺激性、过敏性和溶血性）药物制剂经眼、耳、鼻、口腔、呼吸道、关节腔、皮肤、直肠、阴道、静脉、动脉、肌肉、皮下、静脉旁和鞘内等非口服途径给药，对用药局部产生的毒性（如刺激性和过敏性等）和/或对全身产生的毒性（如过敏性和溶血性等）。是临床前安全性评价的组成部分。毒性来源：药物的活性成分及其代谢物、辅料、杂质等及制剂理化性质（如pH值、渗透压等）。

6、,刺激性试验 1、定义 刺激性：非口服药物制剂对给药部位产生的可逆性炎症改变，给药部位不可逆性的组织损伤则称为腐蚀性。2、刺激性试验设计1）实验动物 一般每个试验选择一种动物进行评价。2）给药的频率与期限 依据拟定临床应用情况决定。重复给药 每天给药一次，给药期限最长不超过4周；偶尔给药 单次给药试验。3）可逆性 停药后恢复期观察（局部及相关部位）。4）受试药和对照物 受试物与用于人体制剂一致。以溶媒和/或赋形剂作为阴性对照。必要时采用阳性对照或已上市制剂。5）剂量（浓度和总剂量）设一个与临床制剂相同浓度剂量组，通过给药频率进行剂量调整。,6）给药方式 给药方案、途径和部位 应尽量与临床用药方

7、案一致。给药容积、速率和频率 根据剂量和动物给药部位的解剖和生理特点。可在同一动物身上进行不同给药途径的刺激性试验，并可在对侧进行对照试验。条件：耐受性许可和无相互影响。3、皮肤刺激性试验 1）经皮给药及可能接触皮肤的非口服给药制剂（直肠、阴道给药）应考虑进行皮肤刺激性试验。2）在急性毒性验、长期毒性或皮肤过敏性试验中已经评价过皮肤刺激性，可不必进行单独的皮肤刺激性试验。,3）试验方法 动物 首选家兔48只，雌、雄各半，应设赋形剂对照，采用同体左右侧自身对比。试验前24小时给药区（背部）进行左、右各3cm3cm脱毛（剪、剃或脱毛剂）。损伤皮肤不宜进行试验。在用药部位用砂纸磨或划“井”字并以渗血

8、为度考察破损皮肤的刺激性。给药 不宜通过增加涂敷厚度或加大涂布面积来提高给药剂量。取受试物0.5 ml直接涂于一侧去毛皮肤，用二层纱布（2.5 cm2.5cm）和一层玻璃纸或类似物覆盖，再用胶布和绷带固定；另一侧涂赋型剂对照。贴敷时间至少4小时。贴敷结束后，除去受试物并用温水清洁给药部位。多次给药应连续同时辰，在同一部位给药，贴敷期限一般不超过4周。观察 观察皮肤反应，按评分标准对皮肤红斑和水肿进行评分。单次给药：去除药物后30-60分钟，24、48和72小时肉眼观察记录涂敷部位红斑和水肿等情况。如存在持久性损伤，延长观察期限，观察恢复情况和时间，但延长期不超过14天。出现皮肤刺激性中度以上的

9、动物应对给药局部进行病理学检查。多次给药：每次去除药物后1小时以及再次贴敷前观察及记录红斑、水肿、色素沉着、出血点、皮肤粗糙或皮肤菲薄情况及其发生时间及消退时间，并对红斑及水肿进行评分。末次贴敷后，在去除药物后30-60分钟，24、48和72小时肉眼观察并记录涂敷部位有无红斑和水肿等情况。持久性和中度以上损伤的观察同单次给药。,结果评价：单次给药计算每一观察时间点各组受试物及赋形剂皮肤反应积分平均分值。将受试侧皮肤反应平均分值减去赋形剂皮肤平均分值得到原发性刺激指数，按表进行刺激强度评价。多次给药首先计算每一观察时间点各组原发性刺激积分均值，然后计算观察期限内每天每只动物刺激积分均值即累积刺激

10、指数，进行刺激强度评价。,皮肤刺激反应评分标准,皮肤刺激强度评价标准,4）试验报告 符合GLP实验室管理规范，内容包括：受试物名称、理化性状、配制方法和用量；实验动物的种属、品系、性别、体重和来源（注明动物合格证号和动物级别）；实验动物饲养环境（包括饲料来源、室温、湿度、照明、实验动物设施合格证号）；详细的试验操作；每只动物在每一观察时间点的皮肤反应积分；具体描述其它毒性反应；试验结论等。5）试验结果的解释 该试验系统比人皮肤刺激反应敏感，刺激反应阴性大多可确定为无刺激性，阳性反应要排除假阳性。除非受试物有大范围或长时间的使用，否则轻度刺激性可不予重视。,4.注射给药部位刺激性试验 炎症、组织

11、变性和坏死等不良反应。1）试验方法 试验动物：家兔，每组（单次给药、多次给药）不少于3只。设生理盐水对照，用同体左右侧自身对比。给药方法：途径与临床使用情况一致，可选用耳缘静脉，耳中心动脉、股和背部肌肉，侧胸壁皮下组织等。给药容积和速率应根据动物情况进行相应的调整。给药期限应根据药物拟用于临床的情况来决定，多次给药一般不超过7天。动物观察：单次给药，在给药后48-96小时对动物和注射部位进行肉眼观察；多次给药，每天给药前以及最后一次给药后48-96小时对动物和注射部位进行肉眼观察。观察期结束时应对部分动物进行病理学检查。留下的动物继续观察1421天再进行病理组织学检查，以了解刺激性反应的可逆程

12、度。2）结果评价：根据肉眼观察和病理检查结果，对受试物进行安全性评价。3）试验报告 试验报告应符合GLP实验室管理规范，内容包括：受试物名称、理化性状、配制方法和用量；实验动物的种属、品系、性别、体重和来源（注明动物合格证号和动物级别）；实验动物饲养环境（包括饲料来源、室温、湿度、照明、实验动物设施合格证号）；详细的试验操作；每只动物在每一观察时间点的刺激反应情况；具体描述其它毒性反应；试验结论等。,眼刺激性试验 眼前部表面可逆性组织改变（炎症、变性和坏死等）。1）试验方法 试验动物：首选家兔，动物数每组不少于3只。应设置生理盐水对照组，可采用同体左右侧自身对比法。试验前24小时内对动物进行双

13、眼检查（包括荧光素钠检查）。有眼睛刺激症状、角膜缺陷和结膜损伤动物弃用。给药方法：每只眼睛滴入0.1ml或涂敷0.1g受试物，然后合眼睑约10s。不需冲洗眼睛。用药周期根据拟临床情况决定，多次给药一般不超过4周。眼部观察：单次给药，在给药后1、24、48和72小时对眼部进行检查；多次给药，每天给药前以及最后一次给药后1、24、48和72小时对眼部进行检查。如果在72小时未见任何刺激症状，试验则可结束。如存在持久性损伤，有必要延长观察期限。但一般不超过21天。可使用放大镜、裂隙灯、生物显微镜和其他器械进行眼刺激反应检查。在记录了24h的观察后，可进一步用荧光素染色检查。记录每次检查眼部反应的分值

14、（见表）。观察部位：结膜、角膜、虹膜及其他。,2）结果评价：将每一个观察时间每一动物的眼角膜、虹膜和结膜的刺激反应分值相加得总积分，将一组的积分总和除以动物数，即得最后分值。,眼刺激反应分值标准,眼刺激性评价标准,3）试验报告 内容包括：同上，每只动物在每一观察时间点的眼睛反应分值；具体描述毒性反应；试验结论等。4）试验结果的解释 该试验系统比人眼睛刺激反应敏感，刺激反应阴性大多可确定为无刺激，阳性反应要排除假阳性。除非受试物有大范围或长时间的使用，否则轻度刺激性可不予重视。,被动皮肤过敏试验（PCA）1）基本原理：将致敏动物血清（内含丰富IgE抗体）皮内注射于正常动物。IgE与皮肤肥大细胞的

15、Fc受体结合，使之被动致敏。当致敏抗原激发时，引起局部肥大细胞释放过敏介质，从而使局部血管通透性增加，注入染料可渗出于皮丘，形成一个蓝斑。根据蓝斑范围或分光光度计法测定，判定过敏反应程度。2）试验动物：PCA反应常用的动物是大鼠，亦用小鼠，有时根据试验需要用家兔。因这些动物PCA反应是由IgE介导的。3）试验分组：应设立阴性、阳性对照组和受试物不同剂量组。阴性对照组应给予同体积的溶媒，阳性对照组给予卵白蛋白或天花粉或已知致敏阳性药物。每组动物数至少4只。4）致敏：按临床拟给药途径。隔日致敏一次，共5次。末次致敏后10天左右采血，2000转/分离心10分钟，分离血清，-20保存，2周内备用。5）

16、激发：上述各组抗血清用生理盐水稀释成1:2、1:8、1:32。在背部脱毛34cm2动物皮内注射各组的抗血清0.1mL。经24或48小时后，各组静脉注射与致敏剂量相同的激发抗原加等量的0.5-1%伊文思兰染料共1mL。6）测定及结果评价：30分后麻醉处死各组动物，剪取背部皮肤，测量皮肤内层的斑点大小，直径大于5mm者判定为阳性。,过敏性试验方法,全身主动过敏试验（ASA）1）基本原理 对致敏动物体内静脉注射抗原，观察抗原与IgE抗体结合后导致肥大细胞、嗜碱性细胞脱颗粒、释放活性介质而致的全身性过敏反应。观察受试物经全身给药后对动物引起的过敏性反应。2）试验方法 动物 通常选用体重为300-400

17、克的Hartley种雄性豚鼠。剂量组别 阴性、阳性对照组，低、高剂量组。每组动物至少4只。致敏 致敏途径：按临床给药途径；致敏次数：隔日一次，共5次；致敏剂量：阴性对照组给予同体积溶解药物的溶媒；阳性对照组：给予1-5mg/只牛血清白蛋白或卵白蛋白或已知致敏阳性物质；低剂量组给予临床最大剂量（/kg或m2）；高剂量组给予低剂量的数倍量。激发 激发途径：通常静脉内给药；激发次数：末次注射后第10-14日一次激发；激发剂量：通常为致敏剂量的2-5倍量；观察指标：致敏期间每日观察每只动物的症状，初次和最后一次致敏和激发当日测定每组每只动物的体重。静脉注射后立刻至30分钟，按表5症状详细观察每只动物的反应，症状的出现及消失时间。最长应观察3小时。,过敏反应症状,全身致敏性评价标准,谢谢光临！欢迎讨论！,