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1、1,转基因技术与作物育种,2,转基因育种的概念与优点转基因育种技术的一般操作过程转基因育种技术的应用成果转基因的安全性,3,作物转基因育种就是根据育种目标，从供体生物中分离目的基因，经 DNA重组与遗传转化或直接运载进入受体作物，经过筛选获得稳定表达的遗传工程体，并经过田间试验与大田选择育成转基因新品种或种质资源。转基因作物（GMC，genetically modified crops）,第一节 植物转基因育种概念及优点,4,与常规育种技术相比，转基因育种在技术上较为复杂，要求也很高，但是具有常规育种所不具备的优势：1.拓宽可利用的基因资源；2.培育高产、优质、高抗优良品种提供了崭新的育种途径
2、；3.可以对植物的目标性状进行定向变异和定向选择；4.可以大大提高选择效率，加快育种进程。此外，还可将植物作为生物反应器生产药物等生物制品。,5,Traditional crossbreeding,Recombinant DNA techniques,6,第二节 植物转基因技术的一般操作过程,7,8,技术路线,目的基因分离,植物表达载体的构建,受体材料的准备,遗传转化,转化组织,组织脱分化,转化植株筛选,炼苗,9,1.目的基因的分离,（1）已知基因的获得化学合成法PCR扩增（2）未知基因的获得构建基因组文库，筛选目的基因构建cDNA文库，筛选目的基因mRNA差异显示技术筛选差异表达基因差异蛋白
3、质谱表达技术筛选功能基因,10,pGEM-T,银杏叶RNA提取,反转录cDNA,chs全长cDNA的克隆,TA克隆及测序,向chs两端引入酶切位点,双酶切,定向克隆,导入农杆菌,2.植物表达载体的构建,11,3.受体材料的准备,细胞的全能性：分化细胞脱分化 再分化,12,4.遗传转化,（1）间接转化法农杆菌介导转化法（2）直接转化法 A、基因枪转化法 B、电击法 C、花粉管通道法 D、PEG介导基因转化法,13,根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens),是一种革兰氏阴性土壤杆菌,它含有Ti质粒,能诱导被侵染的植物细胞形成肿瘤,即诱发冠瘿瘤.Ti质粒(包括Ri质粒)上有一
4、段转移DNA,在农杆菌侵染宿主植物时,这段DNA可以转移进植物细胞,并稳定地保留在植物细胞染色体中,变为植物细胞新增加的一群基因,最终能通过有性世代遗传给子代。,返 回,14,基因枪转化法由美国Cornell大学的Sanfor(1987)提出,它的主要原理是将包含目的基因的载体包被在微小的金属微粒(钨粒或金粒)表面,通过高压驱动力加速微粒穿透植物细胞壁,导入受体组织细胞内,然后通过组织培养再生出完整的植株.微粒上的外源DNA进入细胞后,整合到染色体上并得到表达,从而实现基因的转化.。,返 回,15,电击法的主要原理是将原生质体在溶液中与DNA混合,然后利用高压电脉冲作用,使原生质体膜的某些部位
5、被击穿而产生可回复的小孔,外源DNA可通过小孔进入原生质体内,而且不影响经电击处理的原生质体再生植物的能力.,返 回,16,花粉管通道法是利用开花植物授粉后形成的花粉管通道,直接将外源目的基因导入尚不具备正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞,实现目的基因转化.,返 回,17,PEG介导基因转化的主要原理是聚乙二醇(PEG)、多聚-L-鸟核苷酸(pLO)、磷酸钙及高pH值条件下诱导原生质体摄取外源DNA分子.PEG可促使细胞膜与DNA间接触与粘连,并通过引起膜表面电荷的紊乱及干扰细胞间的识别,利于细胞膜间的融合以及外源DNA进入原生质体.,返 回,18,表1 几种植物转基因方法比较,19,5.转化
6、组织 农杆菌介导之叶盘转化法,带有转化基因的农杆菌活化,受体植物,叶盘,侵染,共培养,筛选培养,诱导成苗,20,21,22,6.炼苗,23,一、转基因技术的发展现状,第三节 作物的转基因技术的应用成果,自从1983年第一株转基因烟草获得以来，至今已有120种植物转基因获得成功。1996年全球大面积种植，并不断扩大。,国际农业生物技术应用服务局（ISAAA）统计结果,24,世界银行下属机构预测，世界范围内转基因作物产业的交易额：2010年达到200亿美元，1500万农民种植转基因作物种植国家先后有30多个国家批准了3000多例田间试验，涉及的植物种类有40多种；2000年有13个国家种植商品化转
7、基因植物；2004年有17个国家种植商品化转基因植物。,25,在2008年，转基因作物种植国的数量激增到了25个。其中，种植面积排名前三位的国家分别为，美国（6250万公顷）、阿根廷（2100万公顷）和巴西（1580万公顷）。中国全国生物技术作物种植面积达380万公顷，在全球生物技术作物种植面积超过100万公顷的八个国家中排名第六。欧洲很少与世界上其他商业化种植Bt玉米的国家相比，欧盟的种植规模很小。2008年大约10万公顷Bt玉米在欧盟国家被种植。与美国相比，欧盟的转基因安全管理法规和制度仍然是非常严格的。,26,美国：3900万公顷 加拿大：350万公顷阿根廷：1350万公顷 中国：210
8、万公顷,27,转基因作物种类主要为大豆、玉米、棉花和油菜等，以转基因大豆面积最大。,目标性状抗除草剂：2000年使用抗除草剂大豆、玉米和棉花占转基因作物74%。抗虫和抗病毒病：2000年，Bt玉米、Bt棉花占19%。耐除草剂+抗虫性双价的转基因棉花和玉米占7%。,28,美国三大转基因作物历年种植面积,29,First biotech plant product Flavr Savr tomato,30,我国转基因作物研究与利用概况 我国是世界上第一个商品化种植转基因作物的国家。自行培育的双价转基因烟草的抗病虫性达到60，产量比对照增加15，产值增加20，1992年每亩增收200元，遗憾的是由于
9、市场的原因现已不推广。,到1999年我国已批准中试的转基因作物有48项：包括水稻、小麦、玉米、番茄、白菜、番木瓜、甜瓜、花生、棉花、烟草、广藿香等11种作物；主要目标性状是抗虫、抗病、耐盐、抗冻、耐储藏和抗衰老等。已批准环境释放的有49个品种，涉及水稻、玉米、大豆、马铃薯、番茄、甜椒、线辣椒、棉花、杨树、烟草等10种作物。,31,经全国基因工程安全委员会批准商品化生产的作物已有：我国自行研制开发的抗虫转基因棉花（转Bt及Bt+CpTI双价抗虫棉）；2004年种植转基因棉花370万公顷，占棉花种植面积的50%美国Monsanto公司开发的Bt抗虫棉；延迟成熟期的转基因番茄；抗黄瓜花叶病毒(CMV
10、)转基因番茄；抗CMV转基因甜椒；转查尔酮合酶（CHS）反义RNA基因矮牵牛。,32,由中国农科院生物工程中心开发的Bt棉对棉铃虫有显著的抗性。与对照相比减少农药用量80，并减少用工150个/hm2，以上两者可使每公顷节省1500元，Bt转基因棉种深受棉农的欢迎。,33,第四节 转基因作物的生物安全性,34,直至今天，转基因作物的安全性在全球范围内引起了激烈的争论。反对者认为转基因作物具有极大的潜在危险，可能会对人类健康和人类生存环境造成威胁。在欧洲，转基因作物被一些媒体称之为“恶魔食品”（frankenstein food）。Frankenstein是英国科幻小说中由一个科学家创造、最终又毁
11、灭了这个科学家的怪物。那么，人类研制与种植转基因作物到底是毁灭自己，还是拯救自己呢？,35,对转基因作物的安全性争论，国际上有几个典型的事件。Pusztai事件：英国Rowett研究所有位Pusztai博士，他用转雪花莲凝集素基因的土豆喂大鼠，1998年秋天在英国电视台发表讲话，声称大鼠食用了这种土豆后，体重和器官重量减轻，免疫系统受到了破坏。后果：绿色和平组织、地球之友等反生物技术组织把这种土豆说成“杀手”，并策划了破坏转基因作物试验地等行动，焚烧了印度的两块试验田，甚至美国加州大学戴维斯分校的非转基因试验材料也遭破坏，以致研究生毕业论文都无法如期完成。英国皇家学会组织了同行评审，并于199
12、9年月发表评论，指出Pusztai的试验有六方面的错误：不能确定转基因和非转基因马铃薯的化学成分有差异；对食用转基因土豆的大鼠，未补充蛋白质以防止饥饿；供试动物数量少，饲喂几种不同的食物，且都不是大鼠的标准食物，缺少统计学意义；试验设计差；统计方法不当；试验结果无一致性等。,36,斑蝶事件：1999年5月，康奈尔大学的一个研究组在Nature杂志上发表文章，声称转基因抗虫玉米的花粉飘到一种名叫“马利筋”的杂草上，用马利筋叶片饲喂美国大斑蝶，导致44的幼虫死亡。这一实验结果在科学上没有说服力：玉米的花粉非常重，扩散不远，在玉米地以外米，马利筋叶片/CM2上只找到一个玉米花粉；2000年开始在美国
13、三个州和加拿大进行的田间试验都证明，抗虫玉米花粉对斑蝶并不构成威胁，实验室试验中用倍于田间的花粉量来喂大斑蝶的幼虫，也没有发现对其生长发育有影响。斑蝶减少的真正原因，一是农药的过度使用，二是墨西哥生态环境的破坏。,37,加拿大“超级杂草”事件：由于基因漂流，在加拿大油菜地里发现了个别油菜植株可以抗一种、两种或三种除草剂，因而有人称此为“超级杂草”，并怪罪于转基因。基因漂流并不是从转基因作物开始。如果没有基因漂流，就不会有进化，世界上也就不会有这么多种的植物和现在的作物栽培品种。举例来说，小麦由、三个基因组组成，它是由分别带有、基因组的野生种经过基因漂流合成的。所以，以此来禁止转基因作物，也是没
14、有道理的。,38,中国t抗虫棉破坏环境事件：2002年6月3日，南京环科所与绿色和平组织在北京召开会议，月日China daily上发表了题为“GM Cotton Damage Enviroment”的文章。当天,绿色和平组织在其网站上刊登了南京环科所、绿色和平组织顾问薛达元先生长达26页的英文报告，从而再次引发国际争论，在欧、美产生巨大反响。月日德国农业报发表了题为“中国研究：棉破坏环境巨大”。绿色和平组织的“中国项目主管”声称：“棉农将面对不受控制的超级害虫”、“转基因抗虫棉不但没有解决问题，反而制造了更多的问题”、“棉农将被迫使用更多、更毒的农药”。事实上，抗虫棉在中国实践多年，深受广大
15、棉农的欢迎。中国、美国、德国、加拿大、比利时、印度等国的科学家已在网上纷纷发表评论，反驳绿色和平组织的观点。,39,争论的实质 现在转基因作物的安全性已经成了国际贸易的技术壁垒。由于某些媒体的炒作，对消费者的心理和转基因作物的产业化已经产生了很大的负面影响。我们的判断？,40,我们所要了解的-转基因植物的潜在风险:1.转基因植物释放引发“超级杂草”目前转入植物的基因以抗除草剂的为多，其次以抗虫和抗病毒，然后是抗逆。如果这些基因逐渐在野生种群中定居后，就具有选择优势的潜在可能，成为难以控制的“超级杂草”。,41,2.转基因植物中35S启动子的生物安全性启动子是基因表达所必需的，决定了外源基因表达
16、空间、表达时间和表达强度等，是人们定向改造生物的重要限制因素。最常用的启动子是35S启动子，该启动子能够在植物组织中高水平表达。因此已经被引入许多转基因植物中。潜在风险问题:35S启动子内有一重组热点。（1）如果35S启动子插入到隐性病毒基因组旁，可能会重新活化病毒。（2）启动子插入到某一编码毒素蛋白的基因上游，可能会增强该毒素的合成。（3）当转基因植物被动物或人类食用后，35S启动子可能会插入到某一致癌基因上游，活化并且导致癌变。,42,3.抗生素抗性标记基因的生物安全性抗生素抗性标记基因是否导致的在环境中的传播。目前，转基因作物都使用细菌编码的抗生素抗性基因作为选择性标记。在过去的几年里，
17、越来越多的报道指出:细菌可以获得对多种抗生素的抗性。这导致人们开始怀疑：转基因植物中的抗性基因是否会转移到细菌中。抗性标记基因是否会通过食物在肠道中水平转移至体内微生物，从而影响抗生素治疗的有效性。抗性标记基因产物是否使人体产生抗药性（食品安全性）。,43,4.转基因食品的安全性 1994年美国Caigene公司的转基因延熟番茄经FDA批准上市，成为第一例通过安全评价的转基因植物食品。转基因食品对人类的可能危害主要有3大类：（1）可能含有已知或未知的毒素，对人体产生毒害作用。（2）可能含有已知或未知的过敏源，引起人体的过敏反应。（3）食品某些营养成分或营养质量可能产生变化，使人体出现某种病症。
18、,44,国外对转基因食品管理的现状,1.国际组织 实质等同原则 表型性状的等同 成分等同 2000年卡塔赫纳生物安全协定书62个国家签署 2001年生物安全议定书 130多个国家签署 2003年生物技术食品的风险评估草案 226个国家表示欢迎,45,2.美国,1992年美国公布了转基因作物不需由作市场前评价，除非它引起新的安全性问题。2000 年4月，在国会科学委员会下属的基础研究委员会的调查报告中，坚持认为没有科学的证据之前不能将GMF作为一个新的食品级别 2000年1月美国政府对转基因玉米的种植颁布了限令，以防止害虫对转基因玉米中毒素形成抗药性。美国环境保护局限令美国大部分玉米产区的农场主
19、应至少种植20的传统玉米，在同时种植玉米和棉花的地区，传统玉米要达到50 2001年7月出台了转基因食品管理草案规定，来源于植物且被用于人类或动物的GMF在进入市场之前至少120天，生物工程制造商必须提出申请，并提供此类食品的相关资料，以确认此类食品与相应的传统产品相比具有等同的安全性,46,3.欧盟,欧盟对GMF持反对态度，1998年提出转基因技术安全性之后，其反对态度更加强硬。他们对转基因技术培育的农作物、家畜以及再加工食品加以抵制，尤其对美国的转基因玉米已终止了进口，然而对于西班牙和德国的转基因玉米却没有采取措施 欧盟的法律由两项：欧盟理事会90220令，于1990年4月颁布实施，该法令
20、中规定了转基因生物的批准程序；1997年5月新食品法规定对转基因产品必须加贴标签,47,4.其它国家,日本、澳大利亚、俄罗斯、加拿大、韩国、泰国、巴西的政策基本与国际组织的相同，但是巴西最 近宣布在未查清转基因作物对环境的影响之前，暂时停止种植转基因大豆。发展中国家迫切需要解决粮食问题，对于高产的转基因产品表示欢迎，这些国家技术落后，没有相关的转基因成分的检测条件，对于标识问题也只能处于被动地位，基本是按国际组织的要求和生物安全议定书要求执行,48,我国对转基因食品的对策,1993年12月24日，国家科委颁布实施了基因 工程安全管理办法 1996年7月10日，国家农业部颁布实施了农业 生物基因
21、工程安全管理实施办法 2001年6月6日国务院颁布了农业转基因生物安 全管理条例 2002年4月8日国家卫生部颁布了转基因食品 卫生管理办法,49,由于转基因产品存在一定的风险，如转基因产品本身对人类的毒害作用，转基因作物对环境的破坏性作用，包括转入的外源基因在环境中的扩散、对物种多样性的影响等，因此必须从保障人类健康、发展农业生产和维护生态平衡与社会安全的基础出发，提出一系列具有指导意义的对应策略和行之有效的具体措施。具体建议如下：1.加强转基因产品的安全性研究：在研究与开发转基因产品的同时，必须加强其安全性防范的长期跟踪研究。,50,2.建立完善的检测体系与质量审批制度：为确保转基因产品进
22、、出口的安全性，必须建立起一整套完善的、既符合国际标准又与我国国情相适应的检测体系，以及严格的质量标准审批制度。有关审批机构应该相对独立于研制与开发商之外，而且也不应该受到过多的行政干预。3.不断完善相关法规：转基因产品安全性法规的建立与执行应该以严格的检测手段为基准。同时应培养一批既懂得生物技术专业知识，又能驾驭法律的专门人才。,51,4.加强宏观调控：有关决策层应对转基因产品的产业化及市场化速度进行有序的宏观调控。任何转基因产品安全性的防范措施都必须建立在对该项技术的发展进行适当调控的前提下，否则，在商业利益的趋动下只能是防不胜防。5.加强对公众的宣传和教育：通过多渠道、多层次的科普宣传教
23、育，培养公众对转基因产品及其安全性问题的客观公正意识，从而培育对转基因产品具有一定了解、认识和判断能力的消费者群体。这对于转基因产品能否获得市场的有力支撑是至关重要的。,52,6.为公众提供良好的咨询服务：应该设立足够数量的具有高度权威性的相关咨询机构，从而为那些因缺乏专业知识而难以对某些转基因产品做出选择的消费者提供有效的指导性帮助。7.规范转基因产品市场：必须培育健康、规范的转基因产品市场。转基因产品的安全性决定其在市场中的发展潜力。因此，有关转基因产品质量及其安全性的广告宣传，应该具有科学性和真实性。一旦消费者因广告宣传而受误导或因假冒产品而被欺骗，转基因产品就会因消费者的望而生畏而失去市场。,
