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1、植物组织培养,陈勇,一、培养基的成分及作用二、培养基的制备,概念：本世纪初开始，以植物生理学为基础发展起来的一项技术。即应用无菌操作方法，培养植物的一个离体器官、组织或细胞。这项技术已在快速繁殖、去除病毒、加速育种进程、次生代谢产物生产和种质资源的保存等方面取得了巨大的经济效益、社会效益及生态效益。,根芽形成的激素控制理论：细胞分裂素与生长素的比例与绝对含量，调控着植物组织的形态发生及细胞分化，当比值高时产生芽，低时产生根，比值适中时可能维持原组织生长而不分化。,植物组织培养的优点,1.研究材料来源单一，无性系遗传背景一致2.经济方便效率高3.条件可控误差小4.生长快周期短重复性强5.周年试验
2、或生产,组织培养的几道主要工序：培养器皿的清洗；培养基的配置、分装、包扎和高压灭菌；无菌操作材料的表面灭菌和接种；放入培养室培养；试管苗的种植与初期管理。,操作技术1.洗涤 培养过程中最经常最大量的工作之一，是洗涤培养瓶及其它常用器皿。最常用的洗涤助剂就是家庭用的洗衣粉及肥皂。2.灭菌 有菌的范畴：凡是暴露在空气中的物体，曾经接触过自然水源的物体，至少它的表面，毫无例外都是有菌的。无菌的范畴：经过高温灼烧或蒸煮过后的物体，经其他物理的或化学灭菌方法处理过后的物体，是无菌的。,常用的灭菌方法可分为物理方法和化学方法两大类。（1）培养基的灭菌：常规方法是放入高压灭菌锅内加热加压灭菌。一般少量的液体
3、只要121 即每平方厘米1.1kg的压力20分钟就能达到彻底灭菌。灭菌的功效主要是靠温度，而不是压力。高压灭菌锅的使用可选用以下任一种：A.打开放气阀，煮沸15分钟后再关闭；B 打开放气阀煮沸至大量热蒸汽喷出再关闭；C 先关闭放气阀，待压力上升到0.5kg/cm2 以上时，打开放气阀放出空气，再关闭。,（2）不耐热的物质将采用过滤灭菌 如赤霉素、玉米素、脱落酸、尿素和某些维生素等。过滤灭菌的原理：溶液通过滤膜后，细菌的细胞和孢子等因大于滤膜孔径而被阻。（3）玻璃器皿及耐热用具等可采用干热灭菌 即利用烘箱加热到160-180 的温度来杀灭微生物。（4）用于无菌操作的器械采用灼烧灭菌（5）布制品采
4、用高压灭菌（6）其它,二、培养基的成分及作用,完善的培养基配方：包括大量元素、微量元素、铁盐溶液、碳源、有机附加成分、植物激素、琼脂等。配置中注意8个字：大、微、铁、有、糖、琼、激、PH。,（一）大量元素 植物所需元素，浓度大于0.5mmol/l的应属于大量元素，而小于0.5mmol/l的则属于微量元素。植物必需的元素在体内的生理作用有四方面（P49）。MS培养基的特点：含有很高量的氮、钾，尤其硝酸盐的用量很大，还含有一定数量的铵盐。,（二）微量元素 植物所需的微量元素至少包括铁、硼、锰、锌、钼、铜、钴和氯。微量元素的生理作用主要在酶的催化功能和细胞分化、维持细胞的完整机能等方面。,（三）铁盐
5、 现在培养基中几乎都采用FeEDTA形态的铁盐。铁促进细胞分裂与伸长，还影响到叶绿体的结构组成与叶绿素形成。,（四）有机成分 植物组织需要的一些维生素、氨基酸、肌醇，统称为有机附加成分。维生素有维生素B1（硫胺素）、维生素B6（吡哆醇）、维生素B3或维生素PP（烟酸）、维生素B5（泛酸钙）等 氨基酸中最常用的是甘氨酸。,（五）糖 作用：碳源、碳骨架、提供底物与能源、维持一定的渗透势。常用的碳源是蔗糖，浓度为25%。（六）琼脂 琼脂是最好的固化剂，本身并不提供任何营养。用量一般在4-10g/l之间。,（七）植物激素 植物激素是植物新陈代谢中产生的 天然化合物，它能以极微小的量影响到植物的细胞分化
6、、分裂、发育，影响到植物的形态建成、开花、结实、成熟、脱落、衰老和休眠、萌发等许许多多的生理生化活动。常用种类有：1.生长素类：生理作用（P61），主要有吲哚乙酸（IAA）、萘乙酸（NAA）、吲哚丁酸（IBA）、2，4-D等。,脱分化：使已分化了的停止分裂的细胞失去分化特性，回复到未分化的幼龄状态，恢复细胞分裂的能力。分化阶段：使脱分化形成的处于幼龄状态的细胞团或组织，再产生根、芽、胚状体等有高层次组织结构的特化细胞。,2 细胞分裂素 生理作用：（P63）种类有苄基腺嘌呤（6-BA）、糠基腺嘌（激动素）等。3 赤霉素（GA）生理作用：（P67）4 脱落酸（ABA）生理作用：（P68）5 乙烯
7、生理作用：（P69）,（八）PH 值 PH值即酸碱度 培养的植物材料大多数要求弱酸性的环境，一般用1N的KOH或NaOH调整到的范围内。,（九）其它成分 较常见的有活性炭、抗生素、抗氧化剂、诱变剂、生长抑制剂、促进细胞分裂和胚状体同步发生的药剂等。,植物组织培养培养基的制备,（一）储备液的配置与保存 将配方中的药品一次称量供一段时间使用，即配一些浓溶液，用时稀释，这种浓溶液就是储备液或母液。一般大量元素比使用液浓度高10-100倍，微量元素等可高200-1000倍。,表4-1 MS培养基储备液的配制,培养基的配制,1.先在洁净的不锈钢锅里放入约750ml 蒸馏水，加入所需要的琼脂（8-10克）
8、和糖（30克）。2.加入各种母液(如大量元素100ml，微量元素、有机物、铁盐各10ml），按需要加入植物激素（如2.4-D 20ml、6-BA 5ml）。3.加蒸馏水将最终体积调整到1l。,4.充分混合好以后，用1NKOH（或NaOH)调整PH值到所需值（5.8左右）。5.趁热将培养基倒入三角烧瓶中，可通过玻棒引流。6.包牛皮纸盖并用橡皮筋绑好。7.高压灭菌后取出。,培养基的灭菌：打开放气阀煮沸至大量热蒸汽喷出，5分钟后再关闭放气阀，待压力上升到121度 1.1kg/cm2时，稳压20分钟。然后关闭电源，待压力降为零后，再打开放气阀。,配置1升培养基分工：,称重：1 琼脂 8-10克；2 蔗
9、糖 30克；3 肌醇 100毫克。母液：1 大量元素 100ml；2 微量元素 10ml；3 有机物质 10ml；,配置1升培养基分工：,4 铁盐 10ml；5 生长素 2.4-D 20ml；6 6-BA 2ml.配置：75%酒精 500ml准备：培养皿 1副/人；饭盒解剖刀柄 2把；镊子（大、小）各两把；三角烧瓶 50 ml 4个/人；宽口瓶（大、小）各两个裁牛皮纸、酒精棉球,培养基的配置及灭菌实验准备用品,药品：95%乙醇 1瓶蔗糖 1瓶琼脂 1瓶大量元素（10倍母液）1瓶微量元素（100倍母液）1瓶维生素（100倍母液）1瓶Fe盐（100倍母液）1瓶Ca盐（100倍母液）1瓶2，4-二氯
10、苯氧乙酸（2，4-D）1瓶,器材：棉花 1包橡皮筋 1包PH试纸（4-7）1包牛皮纸 1张蒸馏水 1桶烧杯（100ml500ml或1000ml）各2个培养皿（大）8对三角烧瓶（50ml或100ml）20个,广口瓶（250ml）1个移液管（10ml）3支量筒（100ml）1个镊子（大、中）各1把解剖刀柄 1把解剖刀片 1包剪刀（大）1把加热杯（1000ml、金属、有刻度）1个电炉（1000瓦以上）1个洗瓶 1个,植物组织培养接种和培养 接种：把处理好的材料经无菌操作手续放置到培养基上。外植体：即接种的植物材料。材料处理的第一步：刷洗、冲洗。第二步：用洗衣粉水或肥皂 水浸洗并搅动。第三步：超净台内
11、材料的表 面灭菌,要根据植物材料对灭菌剂的敏感性来选用不同的药剂，确定适宜的处理时间和水洗的次数。次氯酸钙、次氯酸钠氯气过氧化氢原子态氧升汞灭菌效果最好，去除较难，需无菌水刷洗8-10次。95%酒精灼烧表面不同植物、部位、组织年龄及环境状况灭菌时间不同,人为因素（工作人员本身）：工作服、帽、口罩、酒精擦手。,物品因素,器皿和用具,培养皿：洗热压 玻璃器皿：洗干热（干热箱）或晾干 接种用具：用CCL4布擦湿布擦 泡75%95%酒精烧,培养基：湿热,培养材料,外部细菌：用水冲洗化学药剂处理 内部细菌,茎尖培养 加抗生素：青霉素、利福平,操作的空气：洗刷地板95%酒精擦超净工作台 用化学试剂薰蒸,污
12、染来源,无菌操作技术,1、实验器具和材料的准备2、用75%的酒精擦拭超净工作台，然后室内及超净工作台用紫外灯杀菌20min-30min。注意：台面上的用品不要放置太多或重叠放置，以免降低灭菌效果。3、关紫外灯、打开风机，过5-10min进入缓冲间，以75%洗手和手臂，更换无菌服、帽子和口罩。进入接种室。（注：没有特别情况，尽量不要下工作台）,4、用7075的酒精拭擦台面并消毒双手。试验用具也应该用酒精消毒。点燃酒精灯，将金属器械在其火焰上灼烧，冷却待用。注意：所有操作应在火焰近处并经过灼烧进行。金属器械不能过度灼烧，以防退火。移液管不能灼烧，培养瓶口、塑料材料、橡胶材料过火焰不能时间太长。,5
13、、取流水冲洗（至少30min）过的外植体，用一定的消毒剂浸泡消毒，用无菌水冲洗34次，放入无菌培养皿中，置于酒精灯火焰下方，用无菌的接种器械进行分离、切割或其他处理。,6、打开培养瓶，瓶口在灯焰处旋转灼烧，用镊子将培养材料置于培养基上，灼烧镊子放回，灼烧瓶口，盖上瓶塞。7、用酒精擦洗工作台和手。进行下一轮操作。,注意（1）进行培养时，动作要准确敏捷，但又不必太快，以防空气流动，增加污染机会。（2）不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰烧灼消毒或取备品更换。（3）为拿取方便，工作台面上的用品要有合理的布局，原则上应是右手使用的东西放置在右侧，左手用品在左侧，酒精灯置于中央。（4）工作由始至终
14、要保持一定顺序性，组织或细胞在未做处理之前，勿过早暴露在空气中。同样，培养液在未用前，不要过早开瓶；用过之后如不再重复使用，应立即封闭瓶口直立可增加落菌机会。,（5）吸取营养液、细胞悬液及其它各种用液时，均应分别使用吸管，不能混用，以防扩大污染或导致细胞交叉污染。（6）工作中不能面向操作区讲话或咳嗽，以免唾沫把细菌或支原体带入工作台面发生污染。（7）手或相对较脏的物品不能经过开放的瓶口上方，瓶口最易污染，加液时如吸管尖碰到瓶口，则应将吸管丢掉。,接种时在近火焰处打开瓶口，使瓶倾斜，以免空气中微生物落入瓶中,正 确 错 误,整个接种操作应在近火焰处进行，且动作要迅速,正 确 错 误,接种过程中尽
15、可能达到悬空要求,防止操作带来的污染,正 确 错 误,接种时不得用手接触瓶盖内壁或瓶口,正 确 错 误,瓶盖朝上放，接种完毕后立即盖好瓶口,正 确 错 误,接种完一瓶用火烧用具以防止交叉污染产生,种子和分生组织：培养时通常将其贴放在培养基表面，而不是插到培养基内部，以免供氧不足,正 确 错 误,接种茎段：注意形态学下端插入培养基内，而形态学上端露于空气中,正 确 错 误,无菌操作 无菌操作程序：（1）刷洗：表皮冲洗（2）消毒：75%酒精 30秒 0.1生汞 8分钟 无菌水 3次（3）切割：烟草叶片0.50.5cm 4-5片/瓶（4）接种：平放在培养基上（5）温室培养（名字、学号）,接种及培养实验准备用品,用品：75%乙醇 1瓶酒精棉球 1瓶培养基 5瓶烧杯（装升汞、酒精、蒸馏水用）3个饭盒 1个培养皿 1副废液缸 1个,接种及培养实验准备用品,用品：无菌水 1瓶塑料膜 5张解剖刀片 1片打火机 1个手套 1副胡萝卜直根 1段酒精灯 1盏广口瓶（装工业酒精）1个,
