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1、十三 模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的PCR鉴定,一、实验目的：,1.学习用PCR方法检测生物遗传差异；2.了解植物T-DNA插入突变体的鉴定原理。,二、实验原理,1.Ti质粒和T-DNATi质粒是土壤农杆菌的天然质粒，该质粒上有一段特殊的DNA区段，当农杆菌侵染植物细胞时，该DNA区段能自发转移，插入植物染色体DNA中，Ti质粒上的这一段能转移的DNA被叫做T-DNA。人们根据这一现象，将Ti质粒进行改造，将感兴趣的基因放进T-DNA区段中，通过农杆菌侵染植物细胞，实现外源基因对植物的遗传转化。2.T-DNA插入基因内部导致基因突变T-DNA插入到植物染色体上的什么位置，是随机的。如果T
2、-DNA插入某个功能基因的内部，特别是插入到外显子区，将造成基因功能的丧失。所以利用农杆菌Ti质粒转化植物细胞，是获得植物突变体的一种重要方法。,3.用PCR方法鉴定T-DNA插入纯合突变体农杆菌Ti质粒转化植物细胞后，在获得的后代分离群体中，有T-DNA插入的纯合突变体，杂合突变体，和野生型。在突变体研究中，需要的材料是纯合突变体，所以必须从分离群体中将纯合突变体鉴定出来。PCR方法为鉴定纯合突变体提供了有利手段。它利用三个引物LP、RP和BP，其中LP和RP是植物基因组上T-DNA插入位点两测的引物，BP是T-DNA区段上的引物。经过PCR，在野生型植株，LP和RP这对引物扩增出分子量较大
3、的产物（野生型基因，大带）；在杂合突变体，LP和RP能扩增出分子量较大的产物（野生型基因，大带），另外BP和RP还能扩增出分子量较小的产物（小带）；在纯合突变体，只有BP和RP能扩增出分子量较小的产物（小带）。因此，利用以上三种引物做PCR，根据扩增结果能够容易地从群体中区分出纯合突变体。,左引物 LP：TCATCCACCATGGAAGAAAAG 右引物 RP：TTGGATACGATGCGAGTAACC 中间引物LB:TGGTTCACGTAGTGGGCCATCG用LP+RP产生大带：1107bp用LB+RP产生小带：560-860bp,三、实验步骤,实验材料：拟南芥T-DNA插入突变体分离群体
4、30个株号的植株。实验方法：（每人做1个株号的检测）,(一)拟南芥基因组DNA提取,1.原理,分离动物、植物、微生物DNA是进行遗传操作（基因组DNA序列分析、遗传标记分析、基因克隆、基因定位）的第一个步骤。不同的研究目的对DNA的纯度和产量要求不同。如：构建基因文库及用于限制性片断长度多态(RFLP)等对纯度要求高；用于PCR分析的DNA则应不含干扰PCR反应的污染物；用于遗传标记分析的DNA，纯度要求低但产量则要高。,一个好的分离程序应符合三个标准：所得DNA的纯度满足下游操作要求；所得DNA应完整；所得DNA量足够。,DNA在化学上是稳定的，但它在物理上是易碎的，高分子质量的DNA长而弯
5、曲，即具有极微弱的侧向稳定性，易受到最柔和的流体剪切力的伤害，由吸液、振荡、搅拌所致的水流能剪切断DNA双链。提取动物、植物、微生物基因组的DNA所面临的问题不尽相同，在这个实验中学习植物总DNA提取与鉴定。,本实验采用CTAB法。CTAB的主要作用是破膜。CTAB属阳离子表面活性剂，能溶解膜蛋白与脂类，也可解聚核蛋白。在高离子强度的溶液里，CTAB与蛋白质和大多数酸性多聚糖以外的多聚糖形成复合物，但是不能沉淀核酸。因此，CTAB可以用于从大量产生粘多糖的有机体如植物以及某些革兰氏阴性菌（包括E.coli的某些株）中制备纯化DNA。酚/氯仿/异戊醇的作用是去除核酸制品中的蛋白质，并有利于水相与
6、有机相的分开，而且可以消除泡沫。异丙醇或乙醇的作用是脱去DNA周围水分子，使DNA失水而聚合沉淀。,2、药品,CTAB提取液（1000 ml）组成：20 g CTAB 100 ml 1 M Tris-HCl pH 8.0 40 ml 0.5 M EDTA pH 8.0 81.8 g NaCl 0.2%(V/V)-巯基乙醇注：先将除巯基乙醇之外的药品配好，高压蒸汽灭菌后加入巯基乙醇酚/氯仿/异戊醇：25：24：1氯仿/异戊醇：24：1TE缓冲液：Tris-HCl(pH 8.0)10 mmol/L，EDTA 1 mmol/L3 M NaAc（pH 5.2）,3.DNA提取步骤,用液氮将100 mg
7、 幼嫩叶片研磨成细粉，置于1.5 ml 离心管中，加入预热至65的600 l 的2CTAB提取液，轻摇混匀。65水浴1 h，其间轻摇混匀。12000 rpm离心15 min，弃沉淀，取上清转移至另一1.5 ml 离心管中。向上清液加入等体积的氯仿/异戊醇（24：1），轻轻混匀10 min，然后12000 rpm离心15 min，再转移上清入新管。向上清液中加等体积的冷异丙醇，小心混匀。-20 放置30 min，12000 rpm离心10 min，弃上清。用70%乙醇洗涤沉淀一次，12000 rpm稍离心，弃上清。将沉淀在超净工作台上吹干，或空气中晾干。加50 l TE(pH 8.0)放4 缓慢
8、溶解。电泳检测DNA的浓度和质量。,注意事项,1研磨后应迅速加入提取液，因为提取液中含EDTA，能够螯合Mg2+等二价阳离子，防止破碎细胞中的DNA酶降解DNA。2提取过程中，避免剧烈震荡，以免对DNA造成不必要的机械损伤。3.干燥DNA时，要注意过干或过湿都不利于DNA的溶解。,（二）PCR反应,步骤,1.按如下方法调制PCR反应液，因每管加样量少，可几人一组预混除模板DNA之外的成分。分装后各人再加入自己的模板DNA。PCR管上注意写明株号和引物类型：第一管：第二管：10 xTaq buffer 2.5ul 10 xTaq buffer 2.5ul MgCl2 2 ul MgCl2 2 u
9、l 某株号模板DNA 2 ul 某株号模板DNA 2 ul 引物LP 1 ul 引物RP 1 ul 引物RP 1 ul 引物BP 1ul dNTP 1 ul dNTP 1 ul Taq酶 0.2 ul Taq酶 0.2 ul H2O 15.3 ul H2O 15.3 ul 总共 25 ul 总共 25 ul2.PCR程序：94变性5min；94变性1min,50复性1min,72 延伸2min，共30个循环；72最终延伸10min;10保持。3.PCR结束以后，将样品拿出，检查管子上的株号是否清晰，放-20 保存，等待下次实验，电泳检查结果。,（三)PCR结果的电泳检查,步骤,用1XTAE或TBE电泳缓冲液配制1琼脂糖胶；在15 uL PCR产物中加3uL上样缓冲液(6x)，15uL 基因组DNA中加3uL上样缓冲液(6x)，于1%琼脂糖胶上电泳,稳压100（5/cm）；电泳结束，溴化乙锭溶液染色20分钟（如果你的电泳凝胶中不含溴化乙锭）；在紫外灯下或用凝胶成像仪观察、拍照。,PCR产物电泳结果实例，纯合的野生型只有大带，纯合的插入突变型只有小带，杂合的插入突变型有大小2个带,Marker WT T,基因组DNA提取结果实例：左边泳道为分子量Marker,
