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1、第 36 章,RNA的生物合成和加工（转录）RNA Biosynthesis,Transcription,转录(transcription)生物体以DNA为模板合成RNA的过程。,转录,经转录生成的RNA有多种，主要的是rRNA，tRNA，mRNA，snRNA 和 hnRNA,参与转录的物质,原料:NTP(ATP,UTP,GTP,CTP)模板:DNA酶:RNA聚合酶(RNA-pol)其他蛋白质因子,主要内容,第一节 模板和酶第二节 转录过程第三节 转录后加工第四节 RNA复制和逆转录,模板和酶,第一节,一、转录模板,DNA分子上转录出RNA的区段，称为结构基因。DNA双链中按碱基配对规律能指引
2、转录生成RNA的一股单链，称为模板链(template strand)，也称作负链。相对的另一股单链是编码链(coding strand)，也称为正链。,5GCAGTACATGTC 3,3 c g t g a t g t a c a g 5,5GCAGUACAUGUC 3,NAla Val His Val C,编码链,模板链,mRNA,蛋白质,转录,翻译,53,35,模板链,编码链,编码链,模板链,结构基因,不对称转录,在DNA分子双链上某一区段，一股链用作模板指引转录，另一股链不转录；模板链并非永远在同一条单链上。,模板链（含结构基因）,编码链,二、RNA聚合酶,（一）原核生物的RNA聚合酶
3、,核心酶,全酶,此外，每个RNA聚合酶还含有2个Zn离子。,亚基由基因rpoZ编码，Mr为1.10104，曾长期被忽略，甚至许多人不把它作为聚合酶的组分。然而，现在已经肯定，亚基是嗜热水生菌RNA pol必不可少的组分，也是体外变性的RNA pol成功复性所必需的，它与亚基一起构成催化中心，稳定其与 亚基的结合。,E.coli不同因子的性质与功能比较,（二）真核生物的RNA聚合酶(458),三、启动子和转录因子,原核生物一个转录区段可视为一个转录单位，称为操纵子(operon)，包括若干个结构基因及其上游的调控序列。,RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列，称为启动子(promote
4、r)。,LOREM IPSUM DOLOR,RNA聚合酶起始转录需要的辅助因子（蛋白质）称为转录因子(transcriptional factor)。,RNA聚合酶保护法,开始转录,T T G A C AA A C T G T,-35 区,(Pribnow box),T A T A A T Pu A T A T T A Py,-10 区,原核生物启动子保守序列,RNA-pol辨认位点(recognition site),RNA聚合酶全酶结合位点,转录过程,第二节,大肠杆菌RNA聚合酶的作用,起始阶段：在DNA分子上搜索启动子，并将 DNA双螺旋解开一小段。,延伸阶段：选择正确的核苷三磷酸（NT
5、P），催化磷酸二酯键的形成。,终止阶段：检测RNA 合成的终止信号，停止RNA的合成。,特点：不需引物；无核酸外切酶活性。错误率高：1/104105核苷酸,是DNA复制的105倍。,（一）转录起始,转录起始需解决两个问题：RNA聚合酶必须准确地结合在转录模板的起始区域。DNA双链解开，使其中的一条链作为转录的模板。,一、原核生物的转录过程,RNA聚合酶全酶在转录起始区的结合,2.DNA双链解开，约解开17个碱基对。（酶与启动子结合的部位是AT富集区，有利于解链）,1.RNA聚合酶全酶(2)与模板结合,5-pppG-OH+NTP 5-pppGpN-OH 3+ppi,转录起始过程,3.第一个核苷三
6、磷酸(常常是GTP或ATP)结合到全酶上，形成“启动子-全酶-核苷三磷酸”三元起始复合物。,4.第二个核苷酸参入，连结到第一个核苷酸的3羟基上，形成了第一个磷酸二酯键。,因子从全酶上掉下，又去结合其它的核心酶。,RNApol(2)-DNA-pppGpN-OH 3,转录起始复合物:,（二）转录延长,1.亚基脱落，RNApol聚合酶核心酶变构，与模板结合松弛，沿着DNA模板前移；,2.在核心酶作用下，NTP不断聚合，RNA链不断沿53方向延长。,(NMP)n+NTP(NMP)n+1+PPi,DNA上的解螺旋区：在RNA链延伸的同时，RNA聚合酶继续解开它前方的DNA双螺旋，暴露出新的模板链，而后面
7、被解开的两条DNA单链又重新形成双螺旋，DNA上的解螺旋区保持约17个碱基对的长度。,转录空泡(transcription bubble)：,RNA-pol（核心酶）DNA RNA,RNA链的延伸图解,3,5,RNA-DNA杂交螺旋,聚合酶的移动方向,新生RNA,复链,解链,RNA-DNA杂交区：刚合成出来的RNA链与解开的DNA模板链之间可形成一小段RNA-DNA杂交区。随着核心酶的移动，RNA链不断地延伸，杂交区也往前延伸，但后面的杂交区随着DNA双螺旋的恢复，RNA链逐渐被置换出来，因此，杂交区也保持着固定一小段。,5,3,DNA,原核生物转录过程中的羽毛状现象,核糖体,RNA,RNA聚
8、合酶,依赖Rho()因子的转录终止不依赖Rho因子的转录终止,（三）转录终止,指RNA聚合酶在DNA模板上停顿下来不再前进，转录产物RNA链从转录复合物上脱落下来。,分类,A T P,1.依赖 Rho因子的转录终止,因子是基因编码的蛋白质，是一种酶，在水解ATP的情况下，它沿着53方向转录物的3端前进，直到遇到暂停在终止点位置的RNA聚合酶。随后因子通过解链酶的活性解开转录泡（transcription bubble）上的RNA/DNA形成的杂交双螺旋，使RNA转录物得到释放，从而终止转录。,依赖因子（rho factor）的终止子,2.不依赖 Rho因子的转录终止,DNA模板上靠近终止处，有
9、些特殊的碱基序列，转录出RNA后，RNA产物形成特殊的结构来终止转录。,这类终止子结构上有2个特征,（2）发夹结构末端紧跟6个连续的U，这 发夹结构阻碍了聚合酶的进一步延伸，RNA链的合成就终止，酶和 mRNA就从模板DNA上释放。,（1）DNA链的3端附近有回文结构，富 含G-C碱基，随后紧跟的是A-T碱基，转录而形成的RNA具有茎环的发夹 形结构。,不依赖于因子的终止,AT富集区,GC富集区,不依赖因子的终止子结构,茎环结构使转录终止的机理,使RNA聚合酶变构，转录停顿；使转录复合物趋于解离，RNA产物释放。,RNA合成过程,起始,双链DNA局部解开,磷酸二酯键形成,终止阶段,解链区到达基
10、因终点,延长阶段,RNA,启动子（promoter),终止子(terminator),二、真核生物的转录过程,（一）转录起始,真核生物的转录起始上游区段比原核生物多样化，转录起始时，RNA-pol不直接结合模板，其起始过程比原核生物复杂。,结构基因,-GCGC-CAAT-TATA,真核生物启动子保守序列,1.转录起始前的上游区段,转录起始点,TATA盒,CAAT盒,GC盒,增强子,顺式作用元件(cis-acting element),AATAAA,切离加尾,转录终止点,修饰点,外显子,翻译起始点,内含子,OCT-1,OCT-1：ATTTGCAT八聚体,2.转录因子,能直接、间接辨认和结合转录上
11、游区段DNA的蛋白质，或具有识别RNA聚合酶的作用，现已发现数百种，统称为反式作用因子(trans-acting factors)。又称为转录因子(transcriptional factors,TF)。,3.转录起始前复合物(PIC),真核生物RNA-pol不与DNA分子直接结合，而需依靠众多的转录因子帮助间接结合到DNA分子上。,TFF,A,B,由RNA-Pol 催化转录的起始前复合物,H,E,TBP,TAF,TFD-A-B-DNA复合物,TATA,A,B,TBP,TAF,TATA,H,E,起始前复合物组装完成，TFH使CTD磷酸化,RNA-Pol 羧基端结构域,（二）转录延长,真核生物转
12、录延长过程与原核生物大致相似，但因有核膜相隔，没有转录与翻译同步的现象。,5-AAUAAA-,5-AAUAAA-,核酸酶,-GUGUGUG,RNA-pol,AATAAA GTGTGTG,转录终止的修饰点,5,5,3,3,3加尾,AAAAAAA 3 mRNA,（三）转录终止,和转录后修饰密切相关。,DNA复制与转录的比较,相同点,模 板 两股DNA单链均作为模板 为模板链 原 料 dNTP NTP 合成方式 半保留复制 不对称转录 聚合酶种类 DNA聚合酶 RNA聚合酶 RNA引物 需要 不需要 产 物 半保留的双链DNA 单链RNA,不同点,需要DNA为模板 需要核苷三磷酸为原料 遵循碱基配对
13、原则 新链合成方向均为53,1.嘌呤和嘧啶类似物 核酸代谢的拮抗物：抑制核酸合成有关的酶 掺入核酸分子形成异常核酸如：6-巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、2.6二氨基嘌呤、8-氮鸟嘌呤、5-氟尿嘧啶、6-氮尿嘧啶 进入体内变成相应的核苷酸表现抑制作用,三、RNA生物合成的抑制剂 P469,2.DNA模板功能的抑制物（1）烷化剂（2）放线菌素D（actinomycin D）与DNA形成非共价复合物 其作用如同阻遏蛋白抑制DNA转录和复制。色霉素A3、橄榄霉素、光神霉素（3）嵌入染料 使DNA在复制时缺失或增添一个核苷酸，导致移码突变，并能抑制RNA链的起始。,利福平,抑制细菌RNA聚合酶活性,某些常用的转录
14、抑制剂抑制剂 靶酶 抑制作用 利福霉素 细菌的全酶 与亚基结合阻止起始利链霉素 细菌的核心酶 与亚基结合阻止延长放线菌素D 真核DNA 与DNA结合并阻止延长-鹅膏蕈碱 真核RNA Pol 与RNA聚合酶结合,转录后加工,第三节,几种主要的修饰方式,1.拼接(splicing),2.剪切(cleavage),3.修饰(modification),4.添加(addition),tRNA和rRNA被加工的证据,rRNA和tRNA有以下三点特性：1）所有RNA初级转录产物的5末端均是5-三磷酸，而成熟rRNA和tRNA分子的5末端是5单磷酸；2）rRNA和tRNA分子比初级转录产物小很多；3）所有t
15、RNA含有稀有碱基。,（一）rRNA的加工,原核生物rRNA转录初始物:rRNA基因和tRNA基因组成混合操纵子：16SrDNA 23SrDNA 5SrDNA tDNA加工RNA酶对转录初始物切割再加工成熟,原核生物的转录后加工,原核生物有7个rRNA转录单位,RNase,RNase,RNaseE,甲基化碱基甲基化核糖,(二)tRNA的加工大肠杆菌染色体有tRNA基因约60个,原核生物tRNA转录初始物:tRNA基因:型-tRNA 有 3-CCA-OH型-tRNA 无 3-CCA-OHtRNA转录初始物:与rRNA相连几个相同(不同)tRNA连在一起,多顺反子转录单位,加工,RNA酶RNA酶F
16、RNA酶DRNA酶PtRNA核苷转移酶,切开rDNA、tDNA转录产物 间隔序列从3端切断前体分子核酸外切酶,切除型tRNA 3-CCA-OH下游序列（核酸+蛋白）（M1RNA）内切酶，tRNA5端成熟酶 催化型tRNA形成稳定的3-CCA-OH,“斩头”，去尾，剪接，3-末端添加，化学修饰,原核生物tRNA前体分子的加工,b、末端添加：3-端添加CCA序列。,c、修饰：形成稀有碱基如DH2。,RNAaseP,RNAaseF,RNAaseP,RNAaseF,RNAaseD,RNAaseD,ACC,表示核酸内切酶的作用,表示核苷酸转移酶的作用,表示核酸外切酶的作用,表示异构化酶的作用,（三）mR
17、NA的加工 原核细胞的mRNA通常没有转录后的加工过程。,真核生物的转录后加工,4种rRNA，是两个转录单位。18S、5.8S和28SrRNA的前体是45S（一个转录单位）。5SrRNA是单独的一个转录单位。核仁是其转录、加工和装配成核糖体的场所。,一、rRNA的转录后加工,大多数真核细胞 为成熟的 28S 18S 5.8S rRNA 的共同前体,rRNA,由核酶催化进行自身剪接,32S,多数真核生物的rRNA基因不存在内含子，有些含有内含子但并不转录，如果蝇。四膜虫可以自动切去内含子,tRNA前体,二、tRNA的转录后加工,RNA聚合酶催化合成,RNAaseP、内切酶,tRNA核苷酸转移酶、
18、连接酶,ATP,ADP,碱基修饰,约有10%需要酶促修饰,三、真核生物mRNA的转录后加工,核内的初级mRNA称为核不均一RNA(hnRNA),定义：mRNA的原初转录物是相对分子量极大的前提，在核内加工过程中形成大小不等的中间体，即hnRNA,特点：平均分子长度为8-10Kb左右。比mRNA的平均长度(1.8-2Kb）要大4-5倍。hnRNA仅有总量的1/2转移到细胞质内，其余的都在核内被降解掉。,LOREM IPSUM DOLOR,hnRNA是mRNA的前体，证据是：(1)hnRNA和mRNA有相同的序列；(2)hnRNA在体外能作为模板翻译蛋白；(3)两者5端都有帽子结构，表明二者为相同
19、的聚合酶所合成；(4)两者的3端都有多聚腺苷有尾巴。,（一）首、尾的修饰,5端形成 帽子结构(m7GpppGp)3端加上多聚腺苷酸尾巴(poly A tail),加工过程包括：首、尾、剪接、甲基化,帽子结构,(m7GpppGp),5 pppGp,帽子结构的生成,以5-5三磷酸相连,作用:稳定mRNA 5端和翻译的起始有关,步骤1,步骤2,作用位置,加尾:3端加上多聚腺苷酸尾巴(poly A tail),作用：稳定mRNA，mRNA由细胞核进入细胞质所必需的形式,四、RNA生物功能的多样性（核酶）,具有酶促活性的RNA称为核酶。,核酶(ribozyme),Cech和Altman获得了1989年度
20、的诺贝尔化学奖,四膜虫rRNA内含子的二级结构,四膜虫rRNA的剪接采用自我剪接方式,5-端核苷酸序列,最简单的核酶二级结构锤头状结构(hammerhead structure),底物部分,通常为60个核苷酸左右同一分子上包括有催化部份和底物部份 催化部份和底物部份组成锤头结构,除rRNA外，tRNA、mRNA的加工也可采用自我剪接方式。,核酶研究的意义,核酶的发现，对中心法则作了重要补充；核酶的发现是对传统酶学的挑战；利用核酶的结构设计合成人工核酶。,第四节 RNA复制和逆转录(P491),RNA的复制是指 病毒基因组RNA的复制(真核生物RNA的复制只是极个别的现象),概念:由RNA复制酶
21、(RNA replicase)催化,以病毒 RNA为模板的RNA合成。,RNA病毒在宿主细胞内繁殖时,即进行RNA复制。,一、RNA的复制,以四种NTP为底物；专一性地选择病毒RNA为模板；按5 3的方向合成病毒RNA；无外切酶活性（即无校对功能）。,RNA复制酶的催化性质,病毒RNA的复制方式:,1、病毒含正链RNA：进入宿主细胞后先进行病毒RNA复制酶和有关病毒蛋白质的合成（借助于宿主细胞的蛋白质合成体系），然后进行RNA的复制，再装配病毒颗粒。如：噬菌体Q和灰质炎病毒。2、病毒含负链RNA和复制酶：这类病毒进入宿主细胞后，先进行RNA的复制合成正链RNA，再以正链RNA为模板合成病毒蛋白
22、质RNA，然后装配病毒颗粒。如：狂犬病病毒、马水苞性口炎病毒。3、病毒含双链RNA和复制酶：这类病毒进入宿主细胞后，以双链RNA为模板，通过不对称复制产生正链RNA，并以正链RNA为模板合成病毒蛋白质，然后再合成负链RNA并形成双链RNA，再装配病毒颗粒。如呼肠病毒。,二、逆转录,逆转录酶(reverse transcriptase),逆转录(reverse transcription),（一）逆转录病毒和逆转录酶,DNA,RNA,RNA(病毒),概念 以RNA为模板，dNTP为原料，逆转录酶催化，按碱基配对规律合成DNA的过程。逆转录酶,又称为依赖RNA的DNA聚合酶RNA-dependent DNA polymerase,(RDDP),逆转录病毒细胞内的逆转录现象,分子生物学研究可应用逆转录酶，作为获取基因工程目的基因的重要方法之一，此法称为cDNA法。,以mRNA为模板，经逆转录合成的与mRNA碱基序列互补的DNA链。,试管内合成cDNA,cDNA,（二）逆转录研究的意义,逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中的重大发现。逆转录现象说明：至少在某些生物，RNA同样兼有遗传信息传代与表达功能。对逆转录病毒的研究，拓宽了20世纪初已注意到的病毒致癌理论。,
