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1、生 物 工 艺 学（下）,第 一 章绪 论,教材：新编生物工艺学下册 俞俊棠,参考教材 生物工业下游技术 毛宗贵 生物工程下游技术（第二版）刘国诠现代生物分离工程 曹学君生化分离工程 严希康生物分离工程 孙彦生物分离技术 谭天伟,本课程主要内容,生物下游加工过程概论、发酵液的预处理和固液分离方法、细胞破碎、沉淀法、膜分离技术、溶剂萃取法、双水相萃取、吸附法、离子交换法、液相色谱法、亲和分离技术、结晶法、基因工程药物生产实例等,成绩,平时成绩占30%，包括平时作业、课堂(实验报告，提问,点名)等。期末考试占70%，闭卷考试方法总成绩:平时(30%)+期末(70%)。,一、下游加工过程在生物技术中
2、的地位,下游技术（工程）（downstreamprocessing）：对于由生物界自然产生的或由微生物菌体发酵的、动植物细胞组织培养的、酶反应等各种生物工业生产过程获得的生物原料，经提取分离、加工并精制目的成分，最终使其成为产品的技术。,一、下游加工过程在生物技术中的地位,下游技术（工程）（downstream processing）：对于由生物界自然产生的或由微生物菌体发酵的、动植物细胞组织培养的、酶反应等各种生物工业生产过程获得的生物原料，经提取分离、加工并精制目的成分，最终使其成为产品的技术。1、下游加工过程的重要性。（组成、费用和关注程度）,组成：下游加工过程是生物技术的重要组成部分，
3、发酵液或反应液需要经过下游加工过程才能成为成品；费用：传统发酵工业中下游部分的费用占整个工厂投资费用的，而对重组生产蛋白质等基因工程产品，下游加工的费用可占整个生产费用的；关注程度：从第一个基因工程药物，人胰岛素在1982年投产后，人们逐渐认识到下游加工过程的落后有可能会阻碍生物技术的发展。英国政府工业部，于1983年发起生物分离计划(BIOSEP)，专门研究下游加工过程，有7个国家、50家公司参加。1987年英国化学工业会召开了专门讨论下游加工过程的国际会议。美国从1981年开始连续召开了生物产品回收的会议。我国也于1989年在济南召开了一次专门会议。人们逐渐取得了共识；现代生物技术的发展是
4、和下游技术的进步紧密相关的。,二 传统生化产品和基因工程产品回收方法的比较,1.生化产品的类型按用途分类 食品类。保健品类。医用类产品（1998年，719种）。抗生素112种 农业用产品（1998年，36种）。生物试剂类（1998年，975种）。按分子量大小分类 Mass 1000D：酶、抗原、抗体、多肽、蛋白质类按发酵时目的产物所在的位置分类 cell内：胰岛素、白细胞介素、干扰素、重组蛋白质 cell外：抗生素（青霉素、红霉素）、胞外酶（-淀粉酶）,2、传统生化产品和基因工程产品在提取和精制上的差异,传统生化产品都为小分子(工业用酶除外，但它们对纯度要求不高、提取方法较简单)其理化性能数据
5、都为已知，因此放大比较有根据；基因工程产品大多为大分子，必要数据缺乏，放大多凭经验。,由于第一代基因工程产品都以E.coli作为宿主，表达产品处于胞内，提取前需将细胞破碎，细胞内物质释放出来，给提取增加了很多困难；而发酵液中的产物，浓度较低，杂质又多，且一般大分子较小分子不稳定(易失活，如对剪切力)，故提取较困难。大分子(蛋白质)的分离主要困难在于杂蛋白的分离，由于蛋白质都由氨基酸所构成，所以性质相似，分离主要依靠高分辨力的精制方法，如色谱分离等。,三、生物技术下游加工过程的特点,含水多，产物含量低；含菌体蛋白；溶有原来培养基成分；相当多的副产物、杂蛋白、毒素和色素；易被杂菌污染或使产物进一步
6、分解；易起泡，粘性物质多。,1.发酵液的特点,2.整个下游加工过程应遵循下列四个原则,时间短；温度低；pH适中（选择在生物物质的温度范围内）；严格清洗消毒（包括厂房、设备及管路，注意死角），这和传统产品抗生素的生产是一致的。,对基因工程产品还应注意生物安全（biosafety）问题，要防止菌体扩散，一般要求在密封的环境下操作。,3 加工过程的特点,1)应用面广。医药卫生、环保、动植物生长调节、食品和试剂等2)种类繁多。结构功能复杂，生物活性各异。3)目的产物在初始物料中的含量低。青霉素（4.2%）、庆大霉素（0.2%）、干扰素（50ug/ml）。,4)产品价格与产物浓度呈反比,原料中目标产物浓
7、度越低，所需能耗越高，分离过程成本越大。,5)初始物料成分复杂,常需多个步骤,产品总收率低。除少量产物外，还有大量的细胞及碎片、其他代谢物（几百上千种）、培养基成分、无机盐等。,6)生物活性物质的稳定性低。易变质、易失活、易变性，对温度、pH值、重金属离子、有机溶剂、剪切力、表面张力等非常敏感。7)产品的质量要求高，尤其是药品等。成品青霉素对其强致敏原-青霉噻唑蛋白必须控制RIA值（放射免疫测定）小于100（1.5*10-6），蛋白类药物（杂质 2%）、重组胰岛素中杂蛋白小于0.01%。,四、生物技术下游加工过程的一般流程和单元操作 20世纪80年代以来，生物工业下游技术进步很快，出现了很多新
8、概念、新技术、新产品和新装备。大致可分为以下几大类：,（1）固液分离技术（2）细胞破碎技术（3）初步分离纯化技术（4）高度分离纯化技术（5）其他新型分离技术,近20年来，将在污水处理、化学工程和选矿工程上广泛使用的絮凝技术引入到发酵液的预处理上，研究开发了菌体及悬浮物絮凝技术，改善了发酵液的分离性能，加之纤维素助滤剂的开发，大大提高了发酵液的固液分离效率。在固液分离机械方面，也出现了一些性能优良的新型机械，如带式过滤机、连续半连续板框过滤机、螺旋沉降式离心机等。微滤膜可高效分离细微的悬浮粒子。,（1）固液分离技术（2）细胞破碎技术（3）初步分离纯化技术（4）高度分离纯化技术（5）其他新型分离技
9、术,已开发出球磨破碎、压力释放破碎、冷冻加压释放破碎和化学破碎等技术。该技术的成熟使得胞内生物物质的大规模工业化生产成为可能。,（1）固液分离技术（2）细胞破碎技术（3）初步分离纯化技术（4）高度分离纯化技术（5）其他新型分离技术,主要开发了沉淀、离子交换、萃取、超滤等技术。较早出现的是酶及蛋白质的盐析法；有机溶剂沉淀法；双水相萃取技术比较适合于胞内活性物质和细胞碎片的分离，为进一步纯化精制创造了前提；超滤技术解决了生物大分子对pH、热、有机溶剂、金属离子敏感等难题，在生物大分子的分级、浓缩、脱盐等操作中得到了广泛的使用。,（1）固液分离技术（2）细胞破碎技术（3）初步分离纯化技术（4）高度分
10、离纯化技术（5）其他新型分离技术,小分子物质一般可通过离子交换、脱色和结晶、重结晶等方法获得纯度很高的产品。生物大分子的纯化一直是个难题。20世纪70年代以来，逐渐开发出各种色谱（层析）技术，如亲和色谱、疏水色谱、聚焦色谱、离子交换色谱和凝胶色谱等，后两种技术已开始用于批量生产。,（1）固液分离技术（2）细胞破碎技术（3）初步分离纯化技术（4）高度分离纯化技术（5）其他新型分离技术,超临界CO2萃取技术在获得天然生物物质方面有着独特的优势。20世纪80年代以来，已经在许多领域中迅速实现了工业化。如啤酒花中有效成分和咖啡豆中咖啡因的萃取分离。介于反渗透和超滤之间的纳米滤（Nanofiltrati
11、on）技术，由于其能使水和大部分无机盐通过而截留分子量300-1000u的小分子有机物，且操作压力低，在生物工业和水处理中具有广阔的应用前景。渗透蒸发技术、液膜技术及反胶团技术的研究和应用开发等也相继取得了很大的进展。,五、生物技术下游加工过程的一般流程和单元操作,培养液（发酵液）的预处理和固液分离；初步纯化（提取）；高度纯化（精制）；成品加工。,1.一般下游加工过程可分为4个阶段,2.下游加工过程的一般流程,产品的收得率和质量控制。,下游工艺过程决定于产品的性质和要求达到的纯度如产品为菌体本身，则工艺比较简单，只需经过滤、得到菌体，再经干燥就可，如单细胞蛋白的生产。如可以从发酵液直接提取，则
12、可省去固液分离步骤。如为胞外产物则可省去细胞破碎步骤。,六、纯化方法选择的基本原则,1)尽可能简单、低耗、高效、快速。2)分离步骤尽可能少，每步收率尽可能高。A)分离步骤越多，回收率越低；如Y10=0.9510=0.63，Y5=0.955=0.77B)分离步骤多，设备投入大，人员物资消耗大，生产周期长,九、目标蛋白质的表征和分析方法,蛋白质在分离、纯化过程个易发生变化，因此得到的产品应与已知标准品对照，证明为同一物质并检查其纯度。为达此目的，常需用几种方法。1、HPLC选用基于个同原理的两种层析系统(如反相层析和离子交换层析)，如只得到单个对称峰则表明纯度较高；1）聚丙烯酰胺凝胶电泳(PALE
13、)和等电聚焦；2）顺序分列N端和C端顺序分析可用来表征蛋白质：3）其他分析，如氨基酸分析、肽图、免疫化学分析等可进一步提供产品纯度达到均质(homogeneity)和标准品一致的证明。,适合于大规模工业化生产的传统技术经过改造提高后，适应面更宽，效率会更高，仍然显示出强劲的生命力。各种新型高效的过滤机械和离心机械的问世，结晶理论和离子交换技术的新进展，提高了产品的收率、质量和生产效率。,十、生物工业下游技术的发展动态,成本、质量、环保将是该技术发展方向和动力,1.传统分离技术的提高和完善,1）新型分离介质的研究开发 2）子代分离技术3）其他新兴下游技术,2.新技术的研究开发,膜（膜材料和膜制造
14、工艺）、树脂（离子交换树脂和大网格树脂）和凝胶（琼脂糖凝胶为基质，与各种配基结合后制成各种色谱分离介质）是目前主要的新型分离介质。,各种分离纯化技术相互结合、交叉、渗透，形成子代分离技术。如膜技术和萃取、蒸馏、蒸发技术相结合形成了膜萃取技术、膜蒸馏及渗透蒸发技术；色谱技术与离子交换技术等结合形成了离子交换色谱、等电聚焦色谱等。,由溶剂萃取技术衍生出一大批生物工业分离技术，如双水相萃取、超临界CO2萃取、反胶团萃取（细胞碎片去除、细胞胞内物质、酶及蛋白质、天然生物物质的提取分离）；菌体絮凝技术和菌体细胞破碎技术的进展为工业化经济地分离菌体细胞和大规模生产胞内物质创造了技术前提。,本章要求,熟悉下游加工过程的重要性和特点了解下游加工技术的发展过程掌握下游加工过程的主要步骤和主要单元操作,
