真核基因表达调控(IV).ppt

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1、第七章 真核基因的表达调控,本章内容1、真核生物的基因结构与转录活性2、真核基因的转录水平调控3、反式作用因子的调控作用4、真核基因转录调控的主要模式5、其他水平的基因调控,真核生物和原核生物由于基本生活方式不同所决定基因表达调控上的巨大差别。原核生物的调控系统就是要在一个特定的环境中为细胞创造高速生长的条件，或使细胞在受到损伤时，尽快得到修复，所以，原核生物基因表达的开关经常是通过控制转录的起始来调节的。,真核生物（除酵母、藻类和原生动物等单细胞类之外）主要由多细胞组成，每个真核细胞所携带的基因数量及总基因组中蕴藏的遗传信息量都大大高于原核生物。真核基因表达调控的最显著特征是能在特定时间和特

2、定的细胞中激活特定的基因，从而实现预定的、有序的、不可逆转的分化、发育过程，并使生物的组织和器官在一定的环境条件范围内保持正常功能。,真核生物基因调控，根据其性质可分为两大类：,第一类是瞬时调控或称可逆性调控，它相当于原核细胞对环境条件变化所做出的反应，包括某种底物或激素水平升降及细胞周期不同阶段中酶活性和浓度的调节。第二类是发育调控或称不可逆调控，是真核基因调控的精髓部分，它决定了真核细胞生长、分化、发育的全部进程。,在一株玉米的全部细胞内都有发育雌花丝的基因，但是在根、茎、叶上不会长出雌花丝来，只有在形成子房后，在子房的顶端才长出雌花丝。,真核生物基因表达的一般过程,真核基因表达的多级调控

3、,在真核生物中基因表达的调节其特点是:（1）多层次;（2）无操纵子和弱化子;（3）个体发育复杂;（4）受环境影响较小;,研究基因调控3个问题：什么是诱发基因转录的信号？基因调控主要是在哪一步（模板DNA的转录、mRNA的成熟或蛋白质合成）实现的？不同水平基因调控的分子机制是什么？,真核基因组的一般构造特点,一条成熟的mRNA链只能翻译出一条多肽链，不存在操纵子 DNA都与组蛋白和大量非组蛋白相结合，只有小部分裸露 高等真核细胞DNA中很大部分是不转录的，大部分真核细胞的基因中间还存在不被翻译的内含子。真核生物能够有序地根据生长发育阶段的需要进行DNA片段重排，还能在需要时增加细胞内某些基因的拷

4、贝数。,基因转录的调节区相对较大，它们可能远离启动子达几百个甚至上千个碱基对，这些调节区一般通过改变整个所控制基因5上游区DNA构型来影响它与RNA聚合酶的结合能力。真核生物的RNA在细胞核中合成，只有经转运穿过核膜，到达细胞质后，才能被翻译成蛋白质，原核生物中不存在这样严格的空间间隔。许多真核生物的基因只有经过复杂的成熟和剪接过程（maturation and splicing），才能顺利地翻译成蛋白质。,7.1.1 真核基因的典型结构及特点(1)染色体结构复杂 由DNA、组蛋白、非组蛋白等大分子组成。其基本结构物质是DNA和组蛋白。核小体是染色质的基本单位。真核染色体上三要素：DNA复制起

5、始点、着丝点和端粒。目前通用的酵母人工染色体(YAC)以及哺乳动物细胞人工染色体(MAC)就是以此为基础,再加选择标记和插入位点等组建的。,(2)DNA顺序重复,轻度、中度、高度重复序列三种：轻度重复序列：单拷贝基因；一个基因组中有一个或几个拷贝的序列；例如结构基因基本上属于不重复序列，如蛋清蛋白、蚕的丝心蛋白等。中度重复序列：l0个至几百个拷贝的序列;各种rRNA、tRNA及某些结构蛋白基因（如组蛋白基因）。高度重复序列：从几百到几百万个，通常说的卫星DNA就属于高度重复序列。重复序列的存在是真核生物DNA区别于原核生物DNA的一个重要特征。,(3)基因不连续性(interrupted ge

6、ne),基因的编码序列在DNA分子上是不连续的，为不编码的序列所隔开不连续基因是通过mRNA和DNA杂交试验发现的。外显子(exon)：内含子(intron)：外显子和内含子的概念与是否编码氨基酸的概念并不相对应。,从不连续基因到成熟mRNA之间存在着一个基因转录的中间体,叫做初级转录物，叫做不均一核RNA(heterogeneous nuclear RNA,hnRNA)这个基因的初级转录物既含有外显子又含有内合子序列从不均一核RNA到成熟mRNA要经过一转录后的加工拼接过程。真核生物基因的不连续性和转录后加工是真核基因有别于原核基因的又一重要特征。,交界顺序,左,(5,),位点,右,(3,)

7、,位点,外显子,A,64,G,73,G,T,A,62,A,G8,G,84,T,63,12PyNC,65,A,G,N,外显子,内含子,图,13-21,内含子和外显子的交界顺序,GT-AG,法则,(,仿,B.Lewin:,GENES,1997,，,Fig30.3),特异性剪接/选择性剪接,选择性剪接：基因的初始转录物通过不同的剪接方式而实现的外显子的选择性使用。选择性剪接可以利用同一初级转录物得到不同的mRNA，翻译成不同的蛋白质。选择性剪接的方式主要有以下几种：，使用不同的剪接位点，对5末端和3末端的选择性剪接，交替使用外显子，反式剪接（trans-splicing）:使不同的RNA中的外显子连

8、接在一起，即在两个或更多不同的基因初级转录物中的外显子剪接成为一条成熟的mRNA,通过选择外显子上不同的5或3剪接位点进行选择性剪接(a，b)对5末端和3末端的选择性剪接(c、d)内部外显子可以被选择保留或切除(e)多个外显子可以进行不同组合的可变拼接(f)内含子可以被选择保留在mRNA 中(g)等,mRNA选择性剪接的方式,在真核生物中也有些基因是不含内含子的，如组蛋白基因及型、型干扰素基因、大多数酵母蛋白基因等。在一个结构基因中，编码某一蛋白质不同区域的各个外显子并不连续排列在一起，而常常被长度不等的内含子所隔离，形成镶嵌排列的断裂方式。所以，真核基因有时被称为断裂基因(interrupt

9、ed gene)。目前尚不清楚内含子的生理功能。研究发现，只有真核生物具有切除基因中内含子，产生功能型mRNA和蛋白质的能力，原核生物一般不具有这种本领。如果要在原核细胞里表达真核基因，必须首先构建切除内含子的重组基因，才有可能得到所研究的蛋白质。,(4)存在许多基因家族(gene family),来源相同、结构相似、功能相关的基因组成为单一的基因簇或称基因家族。同一家族中的成员有时紧密地排列在一起，成为一个基因簇；更多的时候，它们却分散在同一染色体的不同部位，甚至位于不同的染色体上，具有各自不同的表达调控模式。,简单多基因家族,简单多基因家族中的基因一般以串联方式前后相连。在大肠杆菌中，16

10、S，23S和5S rRNA基因联合成一个转录单位，各种rRNA分子都是从这个转录单位上剪切下来的。在真核生物中，前rRNA转录产物的分子量为45S，包括18S，28S和5.8S三个主要rRNA分子。前rRNA分子中至少有100处被甲基化（主要是核糖的2-OH甲基化），原始转录产物也被特异性RNA酶切割降解，产生成熟rRNA分子。5S rRNA作为一个独立的转录单位，由RNA聚合酶III（而不是聚合酶I）完成转录。,这类基因家族中的基因之间结构相似，基因与基因之间有重复序列隔开，在基因组中分散成多个基因族。各个基因具有单一的非转录和转录单元。例如，rRNA基因、tRNA基因等。,复杂多基因家族,

11、复杂多基因家族一般由几个相关基因家族构成，基因 家族之间由间隔序列隔开，并作为独立的转录单位。现已发现存在不同形式的复杂多基因家族。,海胆的组蛋白基因家族 串联单位中的每一个基因分别被转录成单顺反子RNA，这些RNA都没有内含子，而且各基因在同一条DNA链上按同一方向转录，每个基因的转录与翻译速度都受到调节。研究还表明，在一个特定的细胞中，并不是所有串联的单位都得到转录。胚胎发育的不同阶段或不同组织中，有不同的串联单位被转录，暗示可能存在具有不同专一性的组蛋白亚类和发育调控机制。,发育调控的复杂多基因家族(不同场合表达的多基因家族）,珠蛋白基因基本结构图,有功能的血红蛋白基因的基本结构：三个外

12、显子被两个内含子隔开,7.1.3 真核生物DNA水平上的基因表达调控,分子生物学的最新研究表明，在个体发育过程中，用来合成RNA的DNA模板也会发生规律性变化，从而控制基因表达和生物体的发育。高度重复基因的形成通常与个体分化阶段DNA的某些变化有关。例如，一个成熟的红细胞能产生大量的可翻译出成熟珠蛋白的mRNA，而其前体细胞却不产生珠蛋白。许多情况下，这种变化是由于基因本身或它的拷贝数发生了永久性变化。这种DNA水平的调控是真核生物发育调控的一种形式，它包括了基因丢失、扩增、重排和移位等方式，通过这些方式可以消除或变换某些基因并改变它们的活性。这些调控方式与转录及翻译水平的调控是不同的，因为它

13、使基因组发生了改变。,染色质结构对转录的影响,在细胞分裂间期的细胞核中，染色质的形态不均匀。根据其形态及染色特点可分为常染色质和异染色质两种类型。常染色质：折叠疏松、凝缩程度低，处于伸展状态，碱性染料染色时着色浅。异染色质：折叠压缩程度高，处于凝集状态，经碱性染料染色着色深。真核基因的活跃转录是在常染色质上进行,转录发生之前，染色质常常在特定的区域被解旋或松弛，形成自由DNA并发生DNA局部结构的变化，导致结构基因暴露，促进转录因子与启动区DNA的结合，从而使基因转录。,组蛋白、核小体对染色质结构的影响组蛋白与DNA结合阻止DNA上基因的转录，去除组蛋白基因又能够恢复转录转录活跃的区域也常缺乏

14、核小体的结构 进行活跃基因转录的染色质区段常有富含赖氨酸的组蛋白（H1组蛋白）水平降低、H2A、H2B组蛋白二聚体不稳定性增加、组蛋白乙酰化（acetylation）和泛素化（obiquitination）、以及H3组蛋白巯基活化等现象，这些都是核小体不稳定或解体的因素，核小体的结构消除或改变，会使DNA结构由右旋变为左旋，导致结构基因暴露，促使转录因子与启动区结合，诱发转录。,DNase超敏感位点 活跃表达的基因所在染色质上包含一个或数个DNase超敏感位点，常出现在转录基因的5端启动区，多在调控蛋白结合位点的附近，该处易被核酸酶降解，使DNA裸露，启动基因表达,用DNA酶I处理各种组织的染

15、色质时，发现处于活跃状态的基因比非活跃状态的DNA更容易被DNA酶I所降解。鸡成红细胞（erythroblast）染色质中，-血红蛋白基因比卵清蛋白基因更容易被DNA酶I切割降解。鸡输卵管细胞的染色质中被DNA酶I优先降解的是卵清蛋白基因，而不是-血红蛋白基因。,存在于“灯刷型”染色体（lamp brush）上的环形结构可能与基因的活性转录有关。“灯刷型”染色体只有在两栖类动物卵细胞发生减数分裂时才能被观察到，它是染色体充分伸展时的一种形态。高倍电镜下观察发现，灯刷型染色体上存在许多突起的“泡”状或“环”状结构，有时还能看到RNP沿着这些突起结构移动，表明这些DNA正在被RNA聚合酶所转录。,

16、实例 两栖类和昆虫卵母细胞rRNA基因的扩增非洲爪蟾的染色体上有约450拷贝编码18Sr RNA和28S rRNA的DNA，在卵母细胞中它们的拷贝数扩大了4000倍.,基因扩增,基因扩增是指某些基因的拷贝数专一性大量增加的现象，它使细胞在短期内产生大量的基因产物以满足生长发育的需要，是基因活性调控的一种方式。,基因重排,将一个基因从远离启动子的地方移到距它很近的位点从而启动转录，这种方式被称为基因重排。,通过基因重排调节基因活性的典型例子是免疫球蛋白结构基因和T-细胞受体基因的表达，前者是由B淋巴细胞合成的，而后者则由T-淋巴细胞合成。抗体有100万种以上，一种淋巴细胞只产生一种抗体,免疫球蛋

17、白的肽链主要由可变区（V区）、恒定区（C区）以及两者之间的连接区（J区）组成,V、C和J基因片段在胚胎细胞中相隔较远。编码产生免疫球蛋白的细胞发育分化时，通过染色体内DNA重组把4个相隔较远的基因片段连接在一起，从而产生了具有表达活性的免疫球蛋白基因。,酵母的“交配型转换”,单倍体细胞,MATa or MAT交配型不同交配型的细胞可以接合 相同交配型的细胞不能接合,7.1.3.4 基因变换,交配型互换原理,HO内切核酸酶将MATa基因内的一段24bp的双链DNA切开，产生一段突出的3单链尾端序列(约500个bp)，MATa基因用这一段单链系列插入到HML 基因的同源序列中，以HML 序列为模板

18、，合成一段新的HML 基因序列，再通过重组使 HML 序列整合到MATa序列中，导致MATa转换成MAT。在这个重组过程中，有一段244bp的重组强化子(recombinant enhancer，RE)，对重组起顺式调控作用，RE缺失则不能发生基因转换。,7.1.3.5 基因的丢失,其特点为不可逆性。在细胞分化过程中，通过丢掉某些基因而去除其活性。此现象常在某些低等原生动物，如线虫和昆虫中发现。在一些肿瘤的发生中，因为一些正常基因片断的丢失，导致原癌基因的异常活化，引发恶性细胞过度增生。,DNA甲基化与基因活性的调控,DNA甲基化是最早发现的修饰途径之一，可能存在于所有高等生物中。DNA甲基化

19、能关闭某些基因的活性，而去甲基化则诱导了基因的重新活化与表达。DNA甲基化会导致某些区域DNA构象变化，影响DNA的稳定性和蛋白质与DNA的相互作用，进而控制基因的表达。,一、DNA的甲基化对基因表达影响,如果用基因打靶的方法除去主要的DNA甲基化酶，小鼠的胚胎就不能正常发育而死亡。CpG二核苷酸中C的甲基化导致了1/3以上由于碱基转换引起的遗传病。,1DNA甲基化的主要形式 主要形成5-甲基胞嘧啶(5-mC)，少量N6-甲基腺嘌呤(N6-mA)和7-甲基鸟嘌呤(7-mG)。在真核生物DNA中，胞嘧啶约有5%被甲基化，5-甲基胞嘧啶主要出现在CpG和CpXpG等序列中。,CpG二核苷酸序列通常

20、成串出现并零散地分布于基因组中，此段序列被称为CpG岛。哺乳类基因组中约存在4万个CpG 岛，它们大多位于结构基因启动子的核心序列和转录起始点，其中有60%90%的CpG 被甲基化，CpG 岛在基因表达调控中起重要作用。甲基化的胞嘧啶易发生脱氨基作用,它就变为T,无法被区分。因此,CpG序列极易丢失，高等真核生物中CG序列含量远远低于其理论值。而没有甲基化的胞嘧啶发生脱氨基作用，就可能被氧化成为U，被DNA修复系统所识别和切除，恢复成C。,2、真核生物中的CpG岛与甲基化,不同结构基因上的CG岛,二氢叶酸还原酶,次黄嘌呤磷酸核糖转移酶,核糖体蛋白,二、真核生物甲基化酶的分类,日常型（maint

21、e-nance）甲基转移酶：分I、II、III三类，它们在甲基化母链（模板链）指导下使处于半甲基化的DNA双链分子上与甲基胞嘧啶相对应的胞嘧啶甲基化，例如DNA复制之后新链的甲基化。从头合成（denovo synthesis）甲基转移酶：催化未甲基化的CpG成为mCpG，不需要母链指导，但速度很慢。,三类日常型甲基转移酶的特点,回文序列：5GAATTC3 5GGATCC3 3CTTAAG5 3CCTAGG5,日常型甲基转移酶引起的半甲基化DNA的甲基化,三、甲基化抑制基因转录的机制 DNA甲基化会导致某些区域DNA构象改变，包括甲基化后染色质对于核酸酶或限制性内切酶的敏感度下降，更容易与组蛋白

22、H1相结合，DNase超敏感位点丢失，使染色质高度螺旋化,凝缩成团,直接影响了转录因子于启动区DNA的结合效率的结合活性，不能启始基因转录。DNA的甲基化不利于模板与RNA聚合酶的结合，降低了转录活性。甲基化的CpG 可以通过与甲基化CpG结合蛋白因子MeCP1（methylCpG-binding protein1）的结合间接影响转录因子与DNA的结合。,甲基化对基因转录的影响,四、DNA甲基化程度与转录启动子的关系,对弱启动子来说，少量甲基化就能使其完全失去转录活性。当这类启动子被增强时，即使不去甲基化也可以恢复其转录活性。甲基化密度较高时，即使增强后的启动子仍无转录活性。甲基化对转录的抑制

23、强度与甲基化CpG结合蛋白因子MeCP1结合DNA的能力成正相关，甲基化CpG的密度和启动子强度之间的平衡决定了该启动子是否具有转录活性。,甲基化对基因转录影响模式图,五、DNA甲基化对基因表达的其他影响,DNA甲基化对基因转录的抑制直接参与了发育调控。随着个体发育，当需要某些基因保持“沉默”时，它们将迅速被甲基化，若需要恢复转录活性，则去甲基化。5-甲基胞嘧啶（5-mC）脱氨后变为T，不易被识别，会引起DNA分子可遗传的转化(C T)，如突变发生在DNA功能区，会造成基因表达紊乱。如许多肿瘤中p53基因第273位密码子发生C T突变，导致p53基因功能的失活。,六、DNA 的去甲基化,DNA

24、 去甲基化有两种方式:被动途径:一种N F核因子可以粘附于甲基化的DNA,使粘附点附近的DNA不能被完全甲基化,从而阻断甲基化酶 的作用。主动途径:是由去甲基酶的作用,将DNA的甲基集团移去。,七、DNA甲基化与X染色体失活 雌性胎生哺乳类动物细胞中两条X染色体之一在发育早期随机失活，以确保其与只有一条X染色体的雄性个体内X染色体基因的剂量相同。一旦发生X染色体失活，使该细胞有丝分裂所产生的后代都保持同一条X染色体失活。,X染色体失活机制,在X染色体上存在一个与X染色体失活有密切联系的核心部位称为X染色体失活中心 Xic 位点（X-chromosome inactivation center）

25、，失活染色体上绝大多数基因处于关闭状态，DNA被高度甲基化。Xist基因（Xi-specific transcript）只在失活的X染色体上表达，其产物是一功能性RNA，含有大量的终止密码子，不编码蛋白。这种Xist RNA分子能与Xic位点相互作用，引起后者构象变化，易于结合各种促失活蛋白因子，最终导致X染色体失活。,Xist甲基化与X染色体失活,7.2 真核生物转录水平上的调控,真核基因调控主要也是在转录水平上进行的，受大量特定的顺式作用元件（cis-acting element）和反式作用因子（transacting factor，又称跨域作用因子）的调控，真核生物的转录调控大多数是通过

26、顺式作用元件和反式作用因子复杂的相互作用来实现的。真核生物的转录调控是整个基因表达调控的关键点之一,顺式作用元件：由若干可以区分的DNA序列组成，并与特定的功能基因相连，组成基因转录的调控区，通过与相应的反式作用因子结合，实现对基因转录的调控。反式作用因子：能直接地或间接地识别或结合在各类顺式作用元件核心序列上，参与调控靶基因转录效率的蛋白因子，也被称为转录因子（TF）。,一个完整的基因，不但包括编码区（coding region），还包括5和3端长度不等的特异性序列，它们虽然不编码氨基酸，却在基因表达的过程中起着重要作用。所以，“基因”的分子生物学定义是：产生一条多肽链或功能RNA所必需的全

27、部核苷酸序列。,一、顺式作用元件的调控,1、分类按照功能分为启动子、增强子/强化子、沉默子按照调控水平分为基础转录水平的顺式调控元件，如启动子；特异诱导高效表达的顺式调控元件，如增强子/强化子,顺式作用元件,（2）分类,一般情况下按功能分两类：核心启动子：保证转录起始所必需的、最少的DNA序列，位于转录起始点及其上游2530bp处的TATA盒，它能确定转录起始位点并产生基础水平的转录。上游启动子元件：在有的转录起始点上游存在CAAT盒和GC盒，它们基本不参与起始位点的确定，起调节起始的频率，提高转录效率的作用。,2、启动子（1）概念：存在于结构基因上游，与基因转录启动有关的一段特殊的DNA序列

28、。,不同基因转录的启动子区结构图,胸腺嘧啶激酶,-珠蛋白,SV40早期基因,组蛋白H2B,sextama box,真核生物与原核生物启动子结构比较,真核转录启动与原核的区别,原核启动子有明显共同一致的序列，而真核启动子序列种类很多，序列更复杂。原核生物只需要一种RNA聚合酶全酶，而真核RNA聚合酶要多种蛋白质因子的相互协调作用才能启动转录。原核启动子结合的调控蛋白较少，而真核启动子中DNA序列可与不同蛋白质因子相互作用。,3，增强子及其对转录的影响,增强子是指能使和它连锁的基因转录频率明显增加的DNA序列。作为基因表达的重要调节元件，增强子通常具有下列性质：1、增强效应十分明显，一般能使基因转

29、录频率增加10-200倍。2、增强效应与其位置和取向无关，不论增强子以什么方向排列（53或 35），甚至和基因相距3 kb，或在基因下游，均表现出增强效应；3、大多为重复序列，一般长约50bp，适合与某些蛋白因子结合。其内部常含有 一个核心序列：（G）TGGA/TA/TA/T（G），是产生增强效应时所必需的；4、增强效应有严密的组织和细胞特异性，说明只有特定的蛋白质（转录因子）参与才能发挥其功能；5、没有基因专一性，可以在不同的基因组合上表现增强效应；6、许多增强子还受外部信号的调控，如金属硫蛋白的基因启动区上游所带的增强子，就可以对环境中的锌、镉浓度做出反应。,Enhancer,Gene,5

30、,3,direction of transcription,Enhancer,Enhancer,增强子可能有如下3种作用机制影响模板附近的DNA双螺旋结构，导致DNA双螺旋弯折或在反式因子的参与下，以蛋白质之间的相互作用为媒介形成增强子与启动子之间“成环”连接，活化基因转录；将模板固定在细胞核内特定位置，如连接在核基质上，有利于DNA拓扑异构酶改变DNA双螺旋结构的张力，促进RNA聚合酶II在DNA链上的结合和滑动；增强子区可以作为反式作用因子或RNA聚合酶II进入染色质结构的“入口”。,增强子的作用原理是什么呢？,举例：增强子与不同启动子进行竞争性相互作用在同一时间，一个增强子只能与一个启动

31、子发生作用。两个启动子P1和P2(以及各自的编码序列)的中间是一个增强子。当P1启动子与其特异转录激活子结合后，增强子优先与P1启动子结合，转录P1的序列。如果P2启动子与它的特异转录激活子形成了复合体，这个增强子将与P2启动子结合，使P2基因转录。在这里，竞争增强子就成为P1或P2基因表达的一个开关机制。,4 沉默子 为负性调节元件，当其结合特异蛋白因子时，对基因转录起阻遏作用。最早在酵母中发现，可不受序列方向的影响，也能远距离发挥作用。,5.对基因的转录和成熟有关的DNA序列 所有真核生物基因3端都包含一poly(A)位点，其上游1530 bp处存在一保守序列AATAAA，它们对初级转录产

32、物的准确切割和加poly(A)是必需的，但并不是转录的终止序列。目前还未发现单一位点具有转录终止性能。,步骤1,步骤2,作用位置,200250,真核生物mRNA转录后加工-加polyA尾,真核基因结构图,二、反式作用因子的调控,反式作用因子是参与转录调控的蛋白因子，能直接地或间接地识别或结合在各类顺式作用元件上，与顺式作用元件一起对转录起调控作用。通过蛋白质-DNA，蛋白质-蛋白质相互作用是其发挥功能的基础。RNA聚合酶也属于一种反式作用于转录的蛋白因子。以反式作用影响转录的因子可统称为转录因子（transcription factors，TF）。,1、反式作用因子的分类（1）RNA聚合酶的亚

33、基，它们是转录必须的，但不具有基因特异性。（2）基本转录因子能与RNA聚合酶结合形成起始复合物，但不组成游离聚合酶的成分，也不具有基因特异性。（3）与特异性调控序列结合的转录因子，为个别基因转录所必需，决定该基因的时间、空间特异性表达。通用或基本转录因子(general transcription factors)RNA聚合酶结合启动子所必需的一组蛋白因子。,真核生物的三种RNA聚合酶,2、与RNA 聚合酶 II 相关的基本转录因子,TBP-TATA binding proteinTAF-TBP-associated factors,基本转录因子参与转录过程示意图,3、与顺式作用元件相结合的常

34、见反式作用因子,（1）与CAAT盒结合的反式作用因子 CTF（CAAT box transcription factor）家族是能识别CAAT盒的一组转录因子。其家族成员对各种CAAT盒有相同的亲和力。另一组CAAT区结合蛋白被称为CP家族，CP1具有对-球蛋白和腺病毒晚期基因启动子CAAT区的高亲和力，CP2具有对-血纤蛋白原基因启动子CAAT区的高亲和力，而CP3能与腺病毒DNA相结合。科学家还从小鼠肝细胞里发现两个CAAT区结合蛋白。CBP对序列GCAAT有较强的亲和力，而ACF则对卵清蛋白基因启动子区的CCAAT有高亲和力。,（2）TATA盒结合蛋白,TATA box结合蛋白（TBP）

35、结合于DNA的小沟。TBP特异性识别TATA序列，促进其他转录因子和RNA聚合酶II的结合，确定起始转录的位点。,TBP是 TF D 的一个亚基，能特异性的与TATA框结合，属于通用转录因子,TBP与TATA盒结合示意图,（3）GC区结合因子,GC区结合蛋白SP1与DNA链上包括GGGCGG在内约20bp的序列特异结合。在SV40启动子区，从-70-110bp的6个GC区全部与SP1结合。,（4）八碱基对元件激活蛋白,八碱基对元件也能被多个激活蛋白识别。Oct-1是非淋巴样细胞中结合八碱基对元件的转录激活因子，没有组织特异性，它识别序列ATTTGCAT。Oct-2则是组织特异的激活因子，识别免

36、疫球蛋白基因的ATGCAAAT顺式元件。,反式作用因子举例,4、反式作用因子中的两个功能结构域（1）DNA识别结合域(DNA-binding domain)反式作用因子结构中用来同顺式作用元件结合的结构区域，主要起结合DNA作用。（2）转录活化结构域(transcriptional activation domain）反式作用因子结构中用来同其他蛋白因子结合，参与募集启动子结合蛋白和转录起始复合体，控制基因转录活化的结构区域。,转录因子的DNA结合域和活化结构域是独立发挥作用的，DNA结合域的功能只是把活化结构域“拴在”起始复合体附近，使之能够发挥活化转录的作用。DNA结合域把活化结构域带到转

37、录起点的附近，而DNA结合域和活化结构域之间的联结区域(connector)是具有足够柔性的，这样，不论DNA结合域所结合的具体位点在哪里，都能使活化结构域找到其靶蛋白（转录因子）。,转录因子结构模式图,转录因子结构域组成图,不同反式作用因子的结构域对转录的影响,转录因子对特定DNA序列的识别和结合，很多情况下都是转录因子的某些氨基酸残基形成的-螺旋结构侵入到双链DNA的大沟中，通过氢键、静电荷作用等方式形成较稳定的结合方式。,6.反式作用因子中的DNA识别或结合域,螺旋-转角-螺旋（Helix-turn-helix，H-T-H）锌指（Zinc finger）结构碱性-亮氨酸拉链（basic

38、Leucine zippers）碱性-螺旋-环-螺旋（basic-helix-loop-helix）,螺旋-转角-螺旋(H-T-H)结构,该结构域主要包含两个或以上-螺旋区和螺旋区中间的转折区，主要通过一个靠C端的-螺旋与DNA双螺旋大沟结合。,控制酵母交配型的MAT基因座以及果蝇发育调节基因等同源异型基因编码的同源域蛋白具有这种结构。其他的还包括玉米的Kn1转录因子和水稻的OSH1转录因子等。同源异型基因（同源转换基因）：是一类在胚胎发育中的表达水平对于组织和器官的形成具有重要的调控作用的保守基因。该类基因的突变，会在胚胎发育过程中导致某一器官异位生长，即本来应该形成的正常结构被其他器官取代

39、了。例如，果蝇的同源异型基因Antp（触角足基因）的突变，导致果蝇的一对触角被两条腿所取代。,同源域蛋白结合DNA示意图,靠C端的螺旋3结合在DNA的大沟中，它是蛋白质和DNA的主要接触部位。螺旋1和螺旋2为反平行样式，它们与螺旋3近于垂直，在结构域N端有个伸展的臂与DNA小沟结合，提高结合的稳定性。,锌指（Zinc finger）结构,经典的锌指结构包括二个半胱氨酸(Cys)及二个组氨酸(His)族，其保守重复序列为Cys-X2-4-Cys-X3-Phe-X5-Leu-X2-His-X3-His。其中的Cys和His残基与锌离子(Zn+)形成的配位键，使氨基酸折叠成环，形成类似手指的构型。此

40、结构被称为Cys2/His2锌指。,经典锌指结构示意图,常见的具有锌指结构域的反式作用因子有TFIIIA、SP1、ADRI等，它们所具有的锌指数目一般不一，识别的靶序列也不尽相同。还有一些蛋白虽然功能不清，但其拥有一个或多个锌指结构，把它们也列为转录因子，如TDF、Kruppel等,具有Cys2/His2锌指结构域的一些转录因子,344aa，N端与DNA结合9个锌指，每个30aa与5s rRNA基因内启动子,TF III A结构域示意图,还存在另一种锌指结构，其具有Cys-X2-Cys-X13Cys-X2-Cys样的保守序列，Zn+与4个Cys结合称为Cys2/Cys2锌指，这些蛋白一般无大量

41、重复性锌指，其DNA结合序列较短且对称。这种结构域常出现在类固醇激素受体蛋白，酵母的GAL4转录因子也具有一个这样的锌指结构。Cys2/Cys2锌指与Cys2/His2锌指结构不同，Cys与His是不能互换的。,类固醇激素受体是以二聚体形式发挥其促进转录作用的。它们的两个锌指的功能不同。第1个锌指的右侧控制与DNA结合，第2个锌指的左侧则是控制形成二聚体的能力的。,糖皮质激素特异性,雌激素特异性,碱性-亮氨酸拉链（basic-Leucine zippers）,结构特点为蛋白形成的-螺旋结构上每6个氨基酸就有一个亮氨酸残基，这些亮氨酸出现在-螺旋的一个方向，每两个蛋白组成一个二聚体，使亮氨酸相对

42、排列，形成拉链样结构，在拉链区的氨基端有个约30个残基的碱性区(富含赖氨酸和精氨酸)。此区的作用是与DNA结合，它也形成-螺旋。,亮氨酸拉链结构示意图,肝脏、小肠上皮、脂肪以及某些脑细胞中存在一类C/EBP家族蛋白，GCN4酵母激活因子、CREB（cAMP应答元件结合蛋白）、热休克蛋白原癌基因jun,fos编码产物，它们都具有典型的亮氨酸拉链结构。,不同转录因子的亮氨酸拉链结构氨基酸组成图,碱性-螺旋-环-螺旋（basic-helix-loop-helix）,蛋白质的C端的氨基酸残基形成两个-螺旋，中间被非螺旋的环状结构隔开，蛋白质的N端是碱性区，为DNA结合区。碱性-螺旋-环-螺旋类蛋白通常

43、也是组成二聚体的形式，这才具有结合DNA的能力。肌细胞定向分化调控因子MyoD-1、原癌基因产物Myc及免疫球蛋白链基因增强子蛋白E12都具有这种bHLH结构，而还有一些蛋白因子（如ID等）具有HLH样结构，无碱性区，就不能结合DNA。,两种螺旋-环-螺旋类蛋白氨基酸组成图,bHLH蛋白是以二聚体与DNA结合并发挥作用的。一个同二聚体或一个异二聚体的两个亚基都有碱性区时才能与DNA结合。HLH结构域的作用大概是正确安置这两个(由每个亚基提供一个)碱性区的位置。,二聚体bHLH蛋白与DNA结合模式图,7.常见的转录活化结构域,一般是DNA结合结构域以外的30-100氨基酸残基组成，主要包括以下几

44、种特征性结构酸性-螺旋结构域(acidic helix domain)富含谷氨酰胺结构域(glutamine-rich domain)富含脯氨酸结构域(proline-rich domain),a.酸性-螺旋(acidic-helix)该结构域含有由酸性氨基酸残基组成的保守序列，多呈带负电荷的亲脂性-螺旋，包含这种结构域的转录因子有GAL4、GCN4、糖皮质激素受体和AP-1/Jun等。,b.谷氨酰胺丰富区(glutamine-rich domain)SP1的N末端含有2个主要的转录激活区，氨基酸组成中有25%的谷氨酰胺，很少有带电荷的氨基酸残基。酵母的HAP1、HAP2和GAL2及哺乳动物的

45、OCT-1、OCT-2、Jun、AP2和SRF也含有这种结构域。,c.脯氨酸丰富区(proline-rich domain)CTF家族（包括CTF-1、CTF-2、CTF-3）的C末端与其转录激活功能有关，含有20%-30%的脯氨酸残基，其它如Oct2、Jun哺乳动物转录因子中也富含这种结构。,7.4 真核基因转录调控的主要模式,真核基因转录水平的调控是通过特定反式作用因子和特定顺式作用元件的相互作用实现的。反式作用因子要发挥功能也必需有一个自身活化的过程，这样它才能特异性的结合特定DNA序列，发挥转录调控作用。反式作用因子通过具有的转录活化域活化其他因子促进转录，那通过什么途径使反式作用因子

46、活化呢？,真核生物转录因子活性调节的主要方式,真核基因的表达是一个复杂的过程，细胞作为生命活动的基本单位，通过感知外界环境的变化，作出特定应答，按顺序主要分为三个阶段：感知外界信息（信息由包膜至核内）染色质结构的改变，相应转录因子的活化 特定基因的表达过程,外界的信号刺激要由细胞外传递到核内，使相应基因作出应答，整个传递过程复杂多变，关键的步骤在于如何使信号顺利通过细胞包膜和核膜的阻隔，到达影响基因表达的特定区域，某些特异性活性分子起着承载和传递信号的重要作用。,胞外信号传递入细胞，主要采取一种受体、配体相互作用的方式，下面列出三类主要受体示意图：,能与受体呈特异性结合的生物活性分子则称 配体

47、(ligand)。,受体的定义,是细胞膜上或细胞内能特别识别生物活性分子并与之结合的成分。它能把识别和接受的信号正确无误地放大并传递到细胞内部，进而引起生物学效应的特殊蛋白质，个别是糖脂。,返回,蛋白质的磷酸化与去磷酸化反应共同构成生物体内一种普遍的调节方式，涉及几乎所有生理、病理过程，在细胞信号的传递过程中占有极其重要的地位。,7.4.1 蛋白质的磷酸化、信号传导及基因表达,磷酸化是指由蛋白质激酶催化的把ATP或GTP上位的磷酸基转移到底物蛋白质氨基酸残基上的过程，其逆转过程是由蛋白质磷酸酶催化的，称为蛋白质去磷酸化。,1 蛋白质磷酸化在细胞信号转导中的作用,(1).在胞内介导胞外信号时具有

48、专一应答特点。这种共价修饰调节方式显然比变构调节较少受胞内代谢产物的影响。(2).蛋白质的磷酸化与脱磷酸化控制了细胞内已有的酶“活性”。这种方式能对外界刺激做出更迅速的反应。(3).对外界信号具有级联放大作用；(4).蛋白质的磷酸化与脱磷酸化保证了细胞对外界信号的持续反应。,2.蛋白激酶的种类与功能,根据底物蛋白质被磷酸化的氨基酸残基的种类可分为：细胞受刺激以后，通过蛋白质磷酸化及一系列级联放大过程将胞外信号转化为细胞内信号，从而引起广泛的生理反应。,根据是否有调节物来分又可分成两大类：1.信使依赖性蛋白质激酶:包括胞内第二信使或调节因子依赖性蛋白激酶及激素（生长因子）依赖性激酶两个亚类；2.

49、非信使依赖型蛋白激酶。,细胞间信息物质是由细胞分泌的调节靶细胞生命活动的化学物质的统称，又称作第一信使。,如生长因子、细胞因子、胰岛素等,在细胞内传递信息的小分子物质，如：Ca2+、IP3、DAG、cAMP、cGMP等。返回,第二信使(secondary messenger),信使依赖型蛋白激酶,非信使依赖型蛋白激酶,3.受体分子活化激酶的途径,蛋白激酶是信号传递的载体，不同激酶的活化具有不同的途径，受体偶联G蛋白途径和蛋白激酶受体途径是两种重要方式，通过这两种途径胞外信息被传递入胞内，活化相应的蛋白激酶，激活特定转录因子，发挥转录调控作用。,蛋白激酶受体途径和受体偶联G蛋白途径参与信号转导过

50、程,偶联G蛋白途径（依赖于胞内信使）蛋白激酶A（PKA）、蛋白激酶C（PKC）蛋白激酶受体途径：酪氨酸蛋白激酶（PTK）,、受cAMP水平调控的A激酶(PKA),属于受体偶联G蛋白途径，第二信使是cAMP结构特点：非活性PKA由4个亚基组成，2个为调节亚基，2个为催化亚基，调节亚基与cAMP结合，使催化亚基释放活化PKA能磷酸化底物蛋白的特异丝氨酸或苏氨酸残，改变蛋白的酶活性由PKA介导活化的转录因子常与基因5端常特定DNA序列TGACGTCA结合，该序列被称为cAMP应答元件（CRE）,被A激酶磷酸化的蛋白质其N端上游往往存在两个或两个以上碱性氨基酸，特异氨基酸的磷酸化（X-Arg-Arg-