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1、科研基本训练专题讲座,如何选题和设计课题,高成江,高成江,教授,泰山学者山东大学医学院免疫学研究所 88382292(office),88382113(lab)Office:building 6,Rm 438 Email:,1.尽快完成观念的转变:从“学生”转变为“科研工作者”从“学习”转变为“研究”“探索”克服现在学生的一些弱点：应试教育和就业问题，缺乏对科学研究的激情。众多“杂事”，众多的“节假日”。社会的浮躁与急功近利，潜不下心搞学问。,一、充分发挥自己的学习主动性,2.明确科学研究的目的:科学研究目的:探索人类认识的未知领域,探索真理.发现新事物，新现象；揭示新规律（阐明规律）；提供新
2、认识(新解释)。科研工作者的工作目的.科研的动力：（1）追求真理（好奇心，认死理）(自然科学有无穷魅力)；（2）社会需求（指挥棒）；（3）功利驱使。事业心,上进心,虚荣心,1、定研究“方向”和“领域”所在Lab（导师）固定的研究方向1)熟悉实验室PI的工作（查文献并浏览导师发表的文章）2)参加 Lab meeting,Journal club 3)熟悉实验室工作环境与实验操作(要泡实验室；参与师兄姐实验,第一学期年)，重点是熟悉实验仪器,二、如何选题，要做什么,2、复习文献，写出综述大量查阅并整理“课题”有关文献，撰写综述（是否发表？）(第一学年/学期）1）掌握学科水准;当前重大进展与趋势2）
3、了解焦点与热点;已/正/将进行的研究课题3）(全面)历史、现状、展望;主要研究方法手段，实验技术4）从文献中找蛛丝马迹（依据），按自己的学识创新思维，大胆假设。5）打消阴性（否定）结果的顾虑，阴性实验也具有科学价值(指路标与警示牌),免疫学领域研究热点,肿瘤免疫的研究进展固有免疫的研究进展T细胞分群、分化、发育的研究进展NK细胞的研究进展microRNA与免疫调节自身免疫病的病因及治疗,Key questions:how the innate immune response is regulated?,M,Regulatory proteins:TRIM38,TRIP,hnRNP Umicro
4、RNA:210,147,TRAF-interacting Protein(TRIP):A Novel Component of the Tumor Necrosis Factor Receptor(TNFR)-and CD30-TRAF Signaling Complexes That Inhibits TRAF2-mediated NFkB Activation.J.Exp.Med.1997The Tumor Suppressor CYLD Interacts with TRIP and Regulates Negatively Nuclear Factor B Activation by
5、Tumor Necrosis Factor.J.Exp.Med.2003,查文献，提假设成功的例子,Early embryonic lethality caused by targeted disruption of the TRAF-interacting protein(TRIP)gene.BBRC.2007TRAF-interacting protein(TRIP)is a RING-dependent ubiquitin ligase.BBRC.2007The protein-tyrosine kinase SYK interacts with TRAF-interacting pro
6、tein TRIP in breast epithelial cells.Oncogene.2009,3、定“课题”：凝练科学问题，提出明确的idea 1）导师研究生共同讨论制定，课题不要远离“方向”和“领域”。2）既考虑工作需要，也要尊重研究生的兴趣 3）注重工作的连续性与新领域的开拓 4）课题难易程度要考虑研究生能力5）利用临床资源的研究(注意伦理原则）6）现有的研究基础与工作条件，课题的前期研究工作,Novelty（新颖性）是否要有重要临床或学术价值？是否具有原创性？是否具有应用价值？不是简单重复别人的实验（换材料），不是跟踪。研究别人没有研究过的东西，难，但创新性强别人已研究过的东西，
7、但可以研究它的新功能，容易。,1、明确课题的研究目的和研究内容。研究内容适当（做什么，编“故事”）小心求证 小题大做深做 不要大题小做浅做；“深入”与“全面”矛盾针对研究目的（假说）决定研究内容避免研究内容不足以得到预定目的（小于，少于）避免研究内容超越预定目的（大于，多于）,三、设计课题，如何做,例背景：巨噬细胞活化可诱导新基因A的表达。假设：A基因可调控巨噬细胞的活化。课题：研究A基因对巨噬细胞活化的作用和机制。研究内容1.A基因是否对巨噬细胞活化有作用？研究内容2：A基因调控巨噬细胞活化的机制？结论：A基因是巨噬细胞的活化调控因子。,2、实验设计要严谨全面，特别是对照实验（包括阴性和阳性
8、对照），病例数，严格质控（repeat,duplicate)对照试验检测你的实验体系；一个试验至少要重复三次或更多次；测量的数据要重复三次至六次；临床病例材料要几百例；,3、技术路线要合理,4、实验方法要可靠并公认；动物模型要成熟公认。方法选择：目的决定方法选择；PCR，WB 实验条件选方法；MS 工作者熟练程度选方法 模型：经典与新建（是否需与人一致或接近）,1）新基因的生物信息学分析:编码产物预测分析序列同源性分析蛋白质功能域分析2）新基因的体内表达规律分析mRNA水平的表达谱分析蛋白质水平的表达分析,基因功能研究策略,4）功能获得策略基因转染技术转基因技术5）功能失活策略基于siRNA的
9、基因沉默技术基因敲除 检测的指标：炎性细胞因子的分泌,6）基因编码产物相互作用蛋白的研究免疫共沉淀技术（co-IP)酵母双杂交系统FRED和FRET,主要分子生物学技术,Western blotting-蛋白印迹Confocal microscopy-激光共聚焦Chromatin immunoprecipitation-染色质免疫沉淀Real-time PCR-实时定量PCR流式细胞术,microRNA-210 negatively regulates LPS-induced macrophage activation by targeting NF-B1,Background,Innate
10、immunity,The bodys first line to defense against microbial infection.Macrophages,PRR,Background,Background,NF-B,microRNAs,Background,highly conversed,small non-coding RNA molecules,21-25ntMature miRNA interacts with a specific mRNA through pairing of nucleotide bases between the miRNA sequence and t
11、he 3 untranslated region(3UTR)of specific mRNA,and leads to translational repression or target mRNA degradation In human，700 miRNAsthe expression of 20-30%genes,Background,Taganov et al.NF-B-dependent induction of microRNA miR-146,an inhibitor targeted to signaling proteins of innate immune response
12、s.PNAS.2006;103(33):1248112486.Liu et al.MiR-147,a microRNA that is induced upon Toll-like receptor stimulation,regulates murine macrophage inflammatory responses.PNAS.2009;106(37):1581915824.,Taganov et al.MicroRNAs and immunity:tiny players in a big field.Immunity.2007;26(2):133137.Xiao et al.Micr
13、oRNA control in the immune system:basic principles.Cell.2009;136(1):2636.,OConnell et al.MicroRNA-155 is induced during the macrophage inflammatory response.PNAS.2007;104,16041609.OConnell et al.Inositol phosphatase SHIP1 is a primary target of miR-155.PNAS.2009;106(17):71137118.Cardoso et al.miR-15
14、5 modulates microglia-mediated immune response by down-regulating SOCS-1 and promoting cytokine and nitric oxide production.Immunology.2012;135(1):73-88.,microRNAs play an important role not only in the differentiation and development of immune cells,but also in the regulation of immune response.,Ba
15、ckground,Objective,?,Technical route 1,To identify microRNAs induced by LPS in murine macrophages,Results 1,LPS-induced expression of miR-210 in murine macrophages.,Fasanaro et al.MicroRNA-210 modulates endothelial cell response to hypoxia and inhibits the receptor tyrosine kinase ligand Ephrin-A3.J
16、 Biol Chem.2008;283(23):1587815883.Chan et al.MicroRNA-210 controls mitochondrial metabolism during hypoxia byrepressing the iron-sulfur cluster assembly proteins ISCU1/2.Cell Metab.2009;10(4):273284.Biswas et al.Hypoxia inducible microRNA-210 attenuates keratinocyte proliferation and impairs closur
17、e in a murine model of ischemic wounds.PNAS.2010;107(15):69766981.Chan et al.MicroRNA-210:a unique and pleiotropic hypoxamir.Cell Cycle.2010;9(6):10721083.Tsuchiya et al.MicroRNA-210 regulates cancer cell proliferation through targeting fibroblast growth factor receptor-like 1(FGFRL1).J Biol Chem.20
18、11;286(1):420428.,microRNA-210,To investigate whether HIF1-was involved in LPS-induced miR-210 expression,Technical route 2,Results 2,HIF1-increases miR-210 expression.,To investigate the possible role of miR-210 in LPS/TLR4 signaling for macrophage,Technical route 3,Results 3-1,miR-210 mimics inhib
19、its TLR4-induced proinflammatory cytokines expression.,Results 3-2,miR-210 inhibitor increases TLR4-induced proinflammatory cytokines expression.,Technical route 4,To determine the function and molecular order of miR-210 in the LPS-induced NF-B activation,Results 4,miR-210 targets molecules downstre
20、am of IKK-.,Computational target prediction,Technical route 5,To identify the potential miR-210 targets in the LPS/TLR4 signaling,Results 5,miR-210 targets NF-B1.,Technical route 6,To determine whether miR-210 inhibits expression of endogenous p105/p50,Results 6,miR-210 inhibits p105 expression in physiological conditions.,Technical route 7,To investigate miR-210 inhibited expression of p50 affect p65/p50 binding to the IL-6 promoter,Results 7,miR-210 inhibits p65/p50 binding to IL-6 promoter.,Summary,好的实验设计包括:明确的目标（假说）；严谨的（实验）设计；合理的（技术）路线；可靠的（实验）方法。,祝大家实验顺利事业有成,
