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1、糖类 蛋白质测定,&,1 碳水化合物的测定,8.1 概述一、食品中碳水化合物的种类与营养功能单糖、双糖、低聚糖、多聚糖二、食品中碳水化合物含量三、测定碳水化合物的意义营养功能评价加工工艺评价四、碳水化合物的测定方法物理法、化学法、酶法、色谱法,1.2 可溶性糖类的测定,一、可溶性糖类分析的预处理1.提取液的制备提取剂：水、乙醇提取方法：含脂肪的食品：预先脱脂液体样品：预先浓缩固体样品：7080%乙醇溶液提取2.提液的澄清常用澄清剂要求：能较为完全地除去干扰物质、不影响糖分测定、易于除去。,种类：中性酝醋酸铅乙酸锌、亚铁氰化钾硫酸铜、氢氧化钠澄清剂用量澄清剂的去除,二、还原糖的测定,还原糖是指具
2、有还原性的糖类，如：葡萄糖（分子中含有 游离醛基；果糖含有游离酮基，乳糖、麦芽糖含有游离的潜醛基。蔗糖、低聚糖及多糖等可通过水解生成相应的还原性单糖进行测定。还原糖的测定方法主要有：直接滴定法、高锰酸钾法、萨氏（Somogyi-Nelson）法、碘量法等（一）直接滴定法1 原理 样品中的还原糖与碱性酒石酸铜溶液反应生成红色氧化亚铜沉淀，过量的还原糖将次甲基蓝由蓝色还原为无色，根据样液消耗量可计算出还原糖的含量。,2、试剂碱性酒石酸铜溶液：甲液：硫酸铜、次甲基蓝溶于水并稀释；乙液：酒石酸钾钠、氢氧化钠、亚铁氰化钾溶于水，并稀释。葡萄糖标准溶液：0.1%3、测定方法（1）样品处理 称样7080%乙
3、醇提取加入澄清剂（乙酸锌、亚铁氰化钾）定容静置过滤，收集滤液备用。（2）碱性酒石酸铜溶液的标定确定试剂的葡萄糖相当量（mg葡萄糖/10mL）,准确吸取甲液5mL、乙液5mL加入锥形瓶；加水10mL，玻璃珠；（从滴管中）加入9mL葡萄糖标准液；煮沸30s趁热滴定至终点计算滴定度(mg/10mL)F=cV（3）样品溶液预测（初步确定样品溶液所需测定体积）准确吸取甲液5mL、乙液5mL加入锥形瓶；加水10mL，玻璃珠；煮沸30s 保持沸腾（从滴管中）滴加样品溶液，滴定至终点计录样品消耗体积Vi。,（4）样品溶液滴定准确吸取甲液5mL、乙液5mL加入锥形瓶；加水10mL，玻璃珠；（从滴管中）加入样品溶
4、液Vi1mL；煮沸30s趁热继续滴加样品溶液，滴定至终点计录样品消耗体积V。5 结果计算,（二）高锰酸钾法（费林氏法）1 原理 样品中的还原糖与过量的碱性酒石酸铜溶液（Cu 2+）反应生成红色氧化亚铜沉淀（Cu+），经过滤，用硫酸铁溶液溶解氧化亚铜（Fe3+Fe 2+），再经高锰酸钾滴定，计算氧化亚铜含量，再经查检索表后计算样品中还原糖含量。Cu 2+还原糖 Cu+Cu2O+Fe2(SO4)3+H2SO4=2CuSO4+2Fe SO4+H2O10FeSO4+2KMnO4+8H2SO4=5Fe2(SO4)3+K2SO4+2MnSO4+8H2O,2 试剂碱性酒石酸铜溶液：甲液：硫酸铜溶于水并稀释；
5、乙液：酒石酸钾钠、氢氧化钠溶于水，并稀释。硫酸铁溶液0.01mol/L高锰酸钾标准溶液（用草酸标定）3 仪器古氏坩埚或垂融坩埚、真空泵4 测定方法（1）样品处理称样7080%乙醇提取加入澄清剂（硫酸铜、氢氧化钠）定容静置过滤，收集滤液备用。,（2）测定50mL样品液加入烧杯中加费林试剂甲液、乙液各25mL加热，煮沸2min趁热抽滤热水洗涤加硫酸铁溶解高锰酸钾滴定至终点，记录高锰酸钾消耗量（3）计算,（三）其它方法1 萨氏滴定法2 萨氏比色法3 碘量法4 爱农法5 3,5-二硝基水杨酸法,三、蔗糖的测定,（一）测定原理样品脱脂后，以水或乙醇提取，提取液经澄清处理，以盐酸水解，蔗糖转化为还原糖，然
6、后按还原糖测定方法分别测定水解前后样品液中还原糖含量，差值乘以系数即为蔗糖含量。（二）试剂0.1%转化糖标准液：纯蔗糖1.9000g溶解定容，取50mL盐酸水解（70，15min）中和，定容。（三）样品测定1.样品处理2.处理液2份（其中一份水解）3.按还原糖法测定。,四、计算1 直接滴定法2 高锰酸钾法,四、总糖的测定,食品中的总糖通常是指具有还原性的糖(葡萄糖、果糖、乳糖、麦芽糖等)和在测定条件下能水解为还原性单糖的蔗糖的总量。在营养学上，总糖是指能彼人体消化、吸收利用的糖类物质的总和，包括淀粉。由于在测定条件下，淀粉水解程度较弱，本节所讲的总糖不包括淀粉。（一）直接滴定法 同蔗糖测定测定
7、结果可以以转化糖或葡萄糖计。,（二）蒽酮法1 原理 碳水化合物对强酸和高温特别敏感，在酸存在的条件下连续加热会产生多种呋喃衍生物。这些产物会与其自身或其他产物结合生成褐色和黑色物质，也可以与其他酚类化合物如苯酚、间苯二酚、-萘酚等尤其是杂环氮结合，生成有色产物，从而可非常方便地进行碳水化合物的分析测定。,2 试剂 葡萄糖标准系列（0mg/kg100mg.kg）3 测定方法4 作标准曲线，计算总糖含量,1.3 淀粉的测定淀粉是重要的营养素之一，是人类能量的主要来源。是食品工业的重要原料。淀粉由葡萄糖单位构成的聚合体，按聚合形式不同，可形成两种不同的淀粉分子直链淀粉和文链淀粉。直链淀粉是由葡萄糖残
8、基以-1,4糖苷键结合构成的，分子呈直链状；支链淀粉是由葡萄糖残基以-1,4糖苷键结合构成直链主干，而支链通过第六碳原子以-1,6糖苷键与主链相连，形成“树枝”状支叉结构。粮食的糯性与非糯性由淀粉的组成和性质决定。,一、淀粉的主要性质：水溶性：直链淀粉不溶于冷水，可溶于热水，支链淀粉常压下不溶于水，在加热并加压时可溶解于水。醇溶性：不溶于浓度在30以上的乙醇溶液。水解性：在酸或酶的作用下可以水解为葡萄糖。旋光性：淀粉水溶液具有右旋性，为(+)201.5205。淀粉的糊化：淀粉粒在适当的温度下（55以上），在水中突然溶胀、分裂，形成均匀的糊状液。“-化”淀粉的老化：淀粉溶液在低温下静置一段时间后
9、，溶液变混浊，甚至沉淀。“-化”淀粉的吸附特性：吸附有机溶剂、吸附碘等。,二、食品中的淀粉来源及含量来自原料作为添加剂加入。填充剂、稳定剂、增稠剂、品质改良剂等,淀粉与碘复合体颜色反应,几种主要粮食中的淀粉含量 各种粮食淀粉中直链淀粉含量,*以干物质计,三、淀粉的测定方法 酸水解法、酶水解法、沉淀法、碘结合法（直链淀粉的测定）（一）酸水解法 1.原理 样品经乙醚除去脂肪，乙醇除去可溶性糖类后，用酸水解淀粉为葡萄糖，按还原糖测定方法测定还原糖含过，再折算为淀粉含量。2适用范围及特点 此法适用于淀粉含量较高，而半纤维素和多缩戊糖等其他多糖含量较少的样品。方法操作简单、应用广泛，但选择性和准确性不及
10、酶法。,3 测定方法（1）样品处理 固体样品粉碎称样脱脂去可溶性糖转移 蔬菜等样品捣碎称样脱脂去可溶性糖转移（2）水解 样品悬浮液水浴回流水解2h 冷却加甲基红调pH至6.2以上（黄色）调pH至4.2以下（红色）调pH至7 沉淀杂质（蛋白质、果胶等）脱铅定容过滤，收集滤液 空白试验（3）测定 按还原糖测定方法进行。,4 结果计算（1）高锰酸钾法（2）直接滴定法,（二）酶水解法,1原理 样品经除去脂肪和可溶性糖类后，在淀粉酶的作用下，使淀粉水解为麦芽糖和低分子糊精，再用盐酸进一步水解为葡萄糖，然后按还原糖测定法测定其还原糖含量，并折算成淀粉含量。2.适用范围及特点 本方法不受半纤维素、多缩戊糖、
11、果胶质等多糖的干扰，适合于这类多糖含量高的样品，分析结果准确可靠，但操作复杂费时。3.试剂碘试剂、淀粉酶,4 测定方法（1）样品处理称样脱脂去可溶性糖定容，过滤（2）酶水解滤液糊化冷却加酶水解验证水解程度加热杀酶冷却转移定容过滤（3）酸水解滤液水浴回流水解1h 冷却加甲基红调pH值转移定容（4）测定按还原糖测定方法进行。5 结果计算,（三）旋光法,1 原理 淀粉具有旋光性，在一定条件下旋光度的大小与淀粉的浓度成正比。用氯化钙溶液提取淀粉，用氯化锡沉淀提取液中的蛋白质，测定旋光度，通过计算得淀粉含量。2 应用范围及特点 本法适用于淀粉含量较高，而可溶性糖类含量很少的谷类样品，如面粉、米粉等。方法
12、操作简便、快速。,2 测定方法样品粉碎称样加水加氯化钙提取煮沸15min 冷却转移加氯化锡沉淀杂质定容（以氯化钙溶液）过滤测旋光度3 结果计算（四）肉制品中淀粉的测定（五）直链淀粉的测定,1.4 纤维的测定,纤维是植物性食品的主要成分之一，广泛存在于各种植物体内，其含量随食品种类的不同而异，尤其在谷类、豆类、水果、蔬菜中含量较高。“粗纤维”用来表示食品中不能被稀酸、稀碱所溶解，不能为人体所消化利用的物质，包括食品中部分纤维素、半纤维素、木质素及少量含氮物质，不代表食品中纤维的全部内容。“膳食纤维”是指食品中不能被人体消化酶所消化的多糖类和木质素的总和。它包括纤维素、半纤维素、戊聚糖、本质素、果
13、胶、树胶等。“膳食纤维”比“粗纤维”更能客观、准确地反映食物的可利用率。,一、粗纤维的测定（重量法）,1 原理 样品在热的稀硫酸作用下，水解除去样品中的糖类杂质干扰，经热的氢氧化钾处理，除去蛋白质、脂肪干扰。再用乙醇印乙醚处理以除去单宁、色素及残余的脂肪，所得的残渣即为粗纤维，如其中合有无机物质，可经灰化后扣除。2 适用范围与特点适用于各类食品，是应用最广泛的经典分析法。方法操作简便、迅速,3 测定方法（1）样品酸解 称样2030g（5.0g干样）锥形瓶 加1.25%硫酸200ml（预先煮沸）锥形瓶 加热回流30min（保持微沸）（2）过滤，沸水洗涤（3）碱解 滤渣+1.25%氢氧化钾200m
14、l（预先煮沸）锥形瓶 加热回流30min（保持微沸）（4）过滤，沸水洗涤（5）乙醇洗涤、乙醚洗涤（6）烘干（105）至恒重（7）灼烧（550）至恒重,4 结果计算,二、中性洗涤纤维（NDF）的测定,1 原理 样品经热的中性洗涤剂浸煮，水洗去除蛋白质、游离淀粉、矿物质，加入淀粉酶水解结合态淀粉，再经水、丙酮洗涤去除脂肪、色素等，残渣经烘干即为中性洗涤纤维。2 适用范围 适用于谷物及其制品、饲料、果蔬等样品，对于蛋白质、淀粉含量高的样品，易形成大量泡沫。粘度大，过滤困难，使此法应用受到限制。所测结果包括食品中全部的纤维系、半纤维素、木质素，最接近于食品中膳食纤维的真实含量，但不包括水溶性非消化性多
15、糖，这是此法的最大缺点。,3 测定方法（1）样品处理 样品粉碎称样（脱脂）锥形瓶（2）中性洗涤剂洗涤中性洗涤剂锥形瓶十氢钠锥形瓶50mg无水亚硫酸钠锥形瓶煮沸1 h（保持微沸）（3）过滤，沸水洗涤（4）加入淀粉酶，抽滤（5）加入淀粉酶，水解1h（6）抽滤，丙酮洗涤（7）烘干，称量（8）结果计算,三、酸性洗涤纤维（ADF）的测定,1 原理 样品经磨碎烘干，用十六烷基三甲基溴化铵的硫酸溶液回流煮沸，除去细胞内容物，经过滤、洗涤、烘干，残渣即为酸性洗涤纤维。2 测定方法（1）样品磨碎（16目）干燥（2）称样（3）加入酸性洗涤剂，加热回流2h。（4）过滤（5）水洗（6）丙酮洗涤（7）烘干，称量。（8）
16、结果计算,四、膳食纤维的测定,1 甲醇回流，去除低分子糖类、色素、脂肪、蜡质等2 酶解，乙醇分离去除淀粉水解物3 热水抽提水溶性多糖，乙醇沉淀离心分离硫酸酸解碱液中和测定已糖、戊糖、糠醛酸等，得水溶性非消化性多糖4 残渣酸解乙醇沉淀离心分离水解液中和测定已糖、戊糖、糠醛酸等，得水不溶性非消化性多糖5 残渣高浓度低温酸解中和抽滤分离水解液中和测定已糖、戊糖、糠醛酸等，得纤维素6 残渣乙醇洗涤干燥灼烧得木质素含量。7 计算 多糖含量（%）=已糖0.9+戊糖0.88+糠醛酸0.81 膳食纤维（%）=水溶性非消化性多糖水不溶性非消化性多糖纤维素木质素,2 蛋白质含量的测定,2.1 概述蛋白质是一类存在
17、于所有细胞中含量丰富的成分，除了储备蛋白质外，几乎所有的蛋白质对生物功能和细胞结构都非常重要。食品中的蛋白质种类非常复杂，其中很多已经被纯化和定性。蛋白质分子质量的变化范围通常为50001000000u，它们包括氢、碳、氮、氧和硫等元素，20种常见-氨基酸是蛋白质的主要构成。蛋白质可以按照它的成分、结构、生物功能或者溶解特性来分类。如水解简单蛋白质只得到氨基酸，但结合类蛋白质还含有非氨基酸成分。蛋白质有非常独特的构型，它可被各种变性因素，如热、酸、碱、8molL尿素、6mol/L盐酸胍、有机溶剂和去垢剂所改变，其溶解性及功能性也可被变性剂所改变。,氮是存在于蛋白质中的特征元素，不同食品中蛋白质
18、的含量相关很大。由于一些食品的组分具有相似的物化性质而使得对蛋白质的分析变得非常复杂。非蛋白氮可能来自于游离氨基酸、小肽核酸、磷脂、氨基糖、嘌呤以及某些维生素、生物碱、尿酸、脲和氨基离子，因此，食品中的总有机氮主要来自于蛋白质，小部分来自于非蛋白质组分的有机氮。食品中其他主要成分包括脂类和碳水化合物可能会干扰食品蛋白质的分析。目前已建立和完善了大量测定蛋白质的方法。这些方法的基本原理包括利用蛋白质的氮、肽键、芳香族氨基酸和紫外吸收性质以及游离基、光散射性质和染色结合能力。,蛋白质分析的重要性(1)生物活性测定 一些蛋白质包括酶或酶抑制因子和食品科学与营养有关，例如肉类嫩化中的蛋白酶、水果成熟中
19、的果胶酶以及豆类中的胰蛋白酶抑制因子都是蛋白质。(2)功能性质调查 不同种类食品中的蛋白质都有其独特的食品功能性质，例如小麦面粉中的麦醇溶蛋白和麦谷蛋白具有成面团性，牛乳中的酪蛋白在干酪制作中具有凝结作用，而鸡蛋卵清蛋白具有起泡能力。(3)营养标签 总蛋白质含量；氨基酸组成；混合物中的特定蛋白质的含量；蛋白质分离纯化过程中的蛋白质含量；非蛋白氮；蛋白质的营养价值(消化率、蛋白质功效比或氮平衡)。,食品中蛋白质的含量,测定蛋白质的方法可分为两大类：一类是利用蛋白质的共性，即含氮量、肽键和折射率等测定蛋白质含量；另一类是利用蛋白质中特定氨基酸残基、酸性和碱性基因以及芳香基团等测定蛋白质含量。常用的
20、方法为凯氏定氮法（粗蛋白质测定）此外，双缩脲法、染料结合法、酚试剂法、NIR法等也常用于蛋白质含量测定，因其方法简便快速，多用于生产单位质量控制分析。氮基酸总量测定通常采用酸碱滴定法，目前HPLC、氮基酸分析仪也已得到广泛使用。,2.2 蛋白质的测定一、常量凯氏定氮法1 原理 样品中的蛋白质和其他有机成分在催化剂存在下，被硫酸消化，总有机氮转化成硫酸铵，在碱性条件下转化为氨，通过水蒸汽将氨蒸馏至硼酸溶液中形成硼酸铵，用标准酸溶液滴定，测出样品转化后的氮含量。由于非蛋白组分中也含有氮，所以此方法的分析结果为样品中的粗蛋白含量。,2NH2(CH2)2COOH13H2SO4(NH4)2SO4+6CO
21、212SO216H2O 2NaOH(NH4)2SO42NH3+Na2SO4+2H2O2NH3+H3BO3(NH4)2B4O7+5 H2O(NH4)2B4O7+5 H2O+2HCl2NH4Cl+4H3BO3,2 主要仪器,3 测定方法（1）消化（2）蒸馏（3）滴定4 结果计算,二、微量凯氏定氮法1 测定原理同凯氏定氮法2 主要仪器,3 测定方法（1）样品处理 精密称样（约相当氮3040mg）100ml定氮瓶 固体样品0.22.0g 半固体样品25g 液体样品吸取1020ml 加入催化剂、硫酸 0.2g硫酸铜，3g硫酸钾、20ml(一般用5ml)硫酸，硒催化剂1g、5ml硫酸小心加热，至无泡沫产生
22、大火消化，至液体呈蓝绿色澄清透明，再继续加热0.5h。取下放冷，小心加20ml水。转移至100ml容量瓶中，加水定容。取与处理样品相同量的硫酸铜、硫酸钾、硫酸按同一方法做试剂空白试验。,（2）按装定氮装置水蒸气发生瓶内装水至约2/3处，加甲基红指示液数滴及数毫升硫酸，加入数粒玻璃珠以防暴沸；加热煮沸水蒸气发生瓶内的水。（3）蒸馏吸收接收瓶内加入10ml(一般用30ml)2%硼酸溶液及混合指示液1滴，并使冷凝管的下端插入液面下；吸取10.0ml样品消化稀释液由小玻杯流入反应室，并以10ml水洗涤小玻杯使流入反应室内，塞紧小玻杯的棒状玻塞。将10ml 40%氢氧化钠溶液倒入小玻杯，提起玻塞使其缓缓
23、流入反应室，立即将玻塞盖紧，并加水于小玻杯以防漏气。夹紧螺旋夹，开始蒸馏。蒸馏5min，移动接受瓶，使冷凝管下端离开液面，再蒸馏1min。然后用少量水冲洗冷凝管下端外部。,（4）滴定 取下接收瓶，以0.05000mol/L（一般用0.01000 mol/L）盐酸标准溶液滴定至灰色或蓝紫色为终点。同时吸取10.0ml试剂空白消化液作空白试验5 结果计算 X样品中蛋白质的含量，%；V1样品消耗盐酸标准液的体积，ml；V2试剂空白消耗盐酸标准液的体积，ml；N盐酸标准溶液的当量浓度；0.0141mol/L盐酸标准溶液1ml相当于氮克数；m样品的质量(体积)，g(ml)；F氮换算为蛋白质的系数。,优点
24、 可用于所有食品的蛋白质分析中；操作相对比较简单；实验费用较低；结果准确，是一种测定蛋白质的经典力怯；用改进方法(微量凯氏定氮法)可测定样品中微量的蛋白质。缺点 最终测定的是总有机氮，而不只是蛋白质氮；实验时间长(至少需要2h才能完成)；精度差，精度低于双缩脲法；所用试剂有腐蚀性。,三、双缩脲法1原理 在碱性条件下，铜离子和多肽(至少有两个肽键，如双缩脲、多肽和所有的蛋白质)生成的复合物呈紫红色，吸收波长为540nm，比色所得的吸光度值和样品中蛋白质的含量成正比。2测定方法(1)5mL双缩脲试剂和lmL蛋白质溶液(110mg蛋白质mL)混匀。试剂包括硫酸铜、氢氧化钠和酒石酸钾钠以稳定在碱性溶液
25、中的铜离子；(2)混合液在室温下放置15min或30min，然后在540nm处比色，读取吸光度值，并扣去空白；(3)如果反应液不澄清，在测定吸光度前可过滤或离心；(4)用牛血清白蛋白(BSA)建立蛋白质浓度与吸光度的标准曲线。,双缩脲法优点 该方法比凯氏定氮法费用低，速度快(可在不到30min的时间内完成)，是分析蛋白质最简单的方法；比福林酚法、紫外吸收法或比浊法更少发生颜色偏离；几乎没有物质干扰食品中蛋白质的双缩脲反应；不需要测定非多肽或非蛋白质来源的氮。,缺点 不如福林酚法灵敏，分析时至少需要24mg蛋白质；如果存在胆汁素，则吸光度会虚假增加；高浓度的胺盐会干扰反应；不同蛋白质其最终反应产物的颜色不同，如明胶的双缩脲反应产生红紫色；如果有高浓度的脂或碳水化合物存在时，最终的反应溶液中可能会呈乳白色；此方法不是一个测量绝对值的方法，必须用已知浓度的蛋白质(如BSA)或经凯氏定氮法校正。,
