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1、细胞培养无菌操作技术,李伟,无菌操作技术的意义,体外培养细胞缺乏抗感染能力，所以防止污染是决定培养成功或失败的首要条件。即便使用设备完善的实验室，若实验者粗心大意，技术操作不规范,也会导致污染。因而，为在一切操作中最大可能地保证无菌，每一 项工作都必须做到有条不紊和完全可靠。,【培养前准备】,在开始实验前要制定好实验计划和操作程序。有关数据的计算要事先做好。根据实验要求，准备各种所需器材和物品、清点无误后将其放置操作场所(培养室、超净台)内，然后开始消毒。这可以避免开始实验后，因物品不全往返拿取而增加污染机会。,【洗手和着装】,原则上和外科手术相同。在利用超净台工作时，应彻底洗手，要戴口罩、着
2、消毒衣帽，并于开始 操作前用75%酒精消毒手套。如果实验过程中手触及可能污染的物品和出入培养室都要重新用消毒液洗手，换新的口罩、消毒衣帽。,手套的正确带法,手套的正确带法,手套的正确带法,【操作野消毒】,超净工作台台面每次实验前要用75酒精擦洗。然后紫外线消毒30min。在工作台面消毒时切勿将培养细胞和培养用液同 时照射紫外线。消毒时工作台面上用品不要过多或重叠放置，否则会遮挡射线降低消毒效果。一些操作用具如移液器、废液缸、污物盒、试管架等用75%酒精擦洗后置于台内同时紫外线消毒。,【器皿消毒】,需要的器皿均应在使用前放入超净台紫外灭菌。所有用到的器皿（买时已灭菌的除外）都必须经过高压灭菌烘干
3、后，才能放入超净台内。已灭菌的、外包装完好的培养瓶、离心管、冻存管等可以表面经过75%酒精擦拭后直接放入超净台。,【操作注意事项】手消毒与烧灼,双手戴手套后，必须经过75%酒精全面消毒才能接触超净台和培养箱。双手接触外部物件后均应重新消毒。超净台经过30min紫外灭菌后，才能打开通风装置。开始工作的第一步就是点燃酒精灯。以后一切操作，如按装吸管帽、打开或封闭瓶口等，都需在火焰近处并经过烧灼进行。烧灼的时间保持适当的长度，如果是玻璃器皿可以稍长一点，如果是塑料器皿，也应保持5s以上，同时要保证烧灼是全方位的。比如，360度旋转瓶口、从吸管的末端开始等。必要时，可以反复重复烧灼。,【操作注意事项】
4、动作与摆放,进行培养时，动作要准确敏捷，但又不必太快，以防空气流动，增加污染机会。不能用手触及已消毒器皿的内部，如已接触，要用火焰烧灼消毒或取备品更换。各类物件的摆放应适合人体功能学，保证拿取的方便快捷，操作的流畅。,【操作注意事项】瓶口的摆放,培养瓶打开后，应平放在台面上，瓶口保持斜向上。打开的培养液瓶口也应保持适度倾斜放置，避免瓶口垂直放置。在具体操作过程中，也应注意所有的瓶口保持倾斜。,【操作注意事项】瓶盖及吸液,培养细胞较多时，打开的培养瓶盖子应按照一定顺序排放，保证瓶子之间的盖子不乱盖。吸液操作时应注意更换不同的吸管，防止交叉感染。吸液时，动作轻柔，尽量避免吸管碰到瓶口。吸管内有液体
5、时，应保持管头比管尾低，防止内部液体倒流至尾部。,【操作注意事项】培养瓶的拿取,从培养箱内取培养瓶时，先将盖子拧紧，再拿出。并且保持瓶口向上。做镜下观察时，保持盖子是拧紧的状态。操作结束后，培养瓶先拧紧瓶盖，经75%酒精擦拭后，放入培养箱，在培养箱里将培养瓶盖子旋松。培养液瓶、胰酶瓶等的盖子只有在要取液时方能打开，取完后立即烧灼旋紧。比如为两个培养瓶加液时，在为第一个加液后，就应立即盖上盖子，再用再打开，防止瓶口敞开的时间过长。,【操作注意事项】封口膜,封口膜应在超净台开紫外前剪好，75%酒精擦拭后置于超净台内紫外灭菌。封口膜的宽度在1cm左右，长度因瓶口的粗细有不同，但均应保证其旋转的周数在
6、2周以上。封口膜在封口时，拉的力度要适中，不能拉断，也不能缠的过松，保证封口的效果。,【操作注意事项】结束后消毒,实验结束后，规范熄灭酒精灯，即：先盖上灯盖，待火焰熄灭后，拿起灯盖晃动两下再重新盖上。实验结束后，用75%酒精棉球擦拭超净台内部，操作区域最少擦拭3次。超净台外部，操作口处用75%酒精棉球擦拭。培养箱的外门和内部玻璃门用75%酒精棉球擦拭。,【操作注意事项】房间消毒,消毒结束后，拉下超净台玻璃门，打开超净台紫外，消毒30min。无菌培养室用完后用消毒水拖洗地面一次(拖布要专用)，紫外线照射消毒30min。佩戴的眼镜经无菌水（每月用75%酒精棉球擦拭1次）冲洗后放置在专门的区域。退出培养室时，注意关闭照明灯，打开紫外灯。,
