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1、第三章 细胞生物学研究方法,一、细胞形态结构观察一光学显微镜 普通光镜的性能指标：放大率（放大倍数），分辨力，清晰度、焦点深度，镜象亮度 分辨力（分辨率、分辨本领）：能分辨两个物点之间最短距离的能力，通常是以分辨距离来表示的，即分辨距离越小，则分辨力越高。,人肉眼分辨力测试，是规定在明视距离为25cm所分辨的最短间距来表示，正常人肉眼分辨力的极限值是0.1 mm毫米。显微镜的分辨力可按下列公式来计算:R=0.61/NA（R是分辨距离，0.61是常数，是照明光波波长，NA是显微镜物镜的镜口率光学性能指标，每个物镜的外壳上都标有其镜口率的数值）。,分辨距离R与镜口率NA成反比关系 若把最大镜口率1
2、.25（即油镜镜口率）代入公式，可见，最小分辨距离。由于可见光中最短波长（紫光）0.4m（即400nm），普通光镜最大分辨力的理论极限应为0.2m。请记 住 0.2!这个数值就是显微 水平与亚（超）微水平的分界线。,显微镜的分辨力有一定的极限，其放大率受分辨力制约而不可能无限提高。普通光镜放大率的经验界值：有效放大倍数极限 物镜最大镜口率1000 例：普通显微镜的油镜镜口率为1.25，故此台显微镜的最大有效放大倍数为1250倍。高级研究显微镜的油镜镜口率为1.4，则此镜的最大有效放大倍数为1400倍。,如果放大倍数超过限度，则视野中物象会变模糊，细微结构反倒分辨不清，成为了 无效放大。由于物镜
3、镜口率受入射镜口角和介质折射率的限制，不可能再更进一步提高了。所以科学家们从另外两个途径来改进显微镜：i.换用短波长的“照明光源”，来提高分辨力。如：紫外光显微镜、电子显微镜ii.应用特殊光学效应，增强反差，来提高分辨能力。如：相差显微镜、微分干涉显微镜,相差显微镜 phase contrast microscope 原理：光波的三个光学特性：（1）光波有波长。对于光波波长变化，肉眼觉察为颜色变化;（2）光波有振幅。对于光波振幅变化（即振幅差），肉眼觉察为明暗变化；（3）光波有相位（相位是指某一时刻，光在其前进路线上的位置）。对于光相位的变化（即相位差），肉眼是不能觉察的。当光线穿过无色透明且
4、非匀质的被检物体（如活细胞），其波长和振幅都无明显变化，仅光相位出现了一定程度的变化，此时观察会感觉反差较小，对物体内部的结构难分辨，这就是普通光镜不适宜用于观察活细胞的原因。,相差显微镜却是运用一些特殊装置，使通过被检物体的光线分离成两组光波，并人为地促使这两组光波之间微弱的相位差加大，再经过光波干涉作用，使看不见的相位差转变成可见的振幅差，从而造成反差增强，便能够清晰看到被检物体及其内部细微结构了。所以，相差显微镜下的样品标本不需染色，即可以十分清晰地观察活细胞及其内部结构的变化。特点：相差显微镜的观察效果是被检物体比其周围背景略暗，而物体外围显现有一圈明亮的光环。,倒置显微镜则是将相差显
5、微镜的构件颠倒装配，本末倒置而成的，并装有恒温设备、闭路电视和缩时摄象机，是能够完善适用于细胞培养的观察监视系统。微分干涉显微镜却是另一种不需染色而可以直接观察活细胞精细结构及动态变化的技术设备，其分辨率比普通光镜要提高一个数量级。,3.荧光显微镜 fluorescence microscope,原理：以紫外光为光源，使被检材料中的荧光物质激发出荧光，从而对细胞内某些物质进行定性和定位分析。荧光现象有两种：1.自发荧光细胞内某些天然荧光物质被紫外光照射所 激 发 的 荧光，例，叶绿素血红色自发荧光；2.诱发荧光在细胞中加入某种不会使细胞化学组分变性的荧光染料（荧光素），与细胞内某种特定成分结合
6、在一起，经紫外光照射激发出荧光。,例：荧光染料吖啶橙，可使RNA发出红色荧光，而使DNA发出绿色荧光。结构特点：1 采用紫外光发生装置：高压汞灯+激发装置+滤光装置 2 透镜由石英玻璃制成，以便减少光通路上的紫外光损耗 3 目镜中要装压紫滤片,荧光显微镜目前在分子细胞生物学研究中应用十分广泛，以荧光素标记各种探针进行基因定位分析或对某些特定蛋白质进行定性定位检测分析，灵敏清晰。在荧光显微镜下对样品可同时采用两种以上荧光探针检测，依据其不同颜色的荧光信号，我们能一次判断识别多个基因（或蛋白）的位点，因此这是非常实用的研究技术。例如，绿色荧光蛋白 GFP 可用于进行活体观察。此外，由于在荧光标记检
7、测实验中，易发生一些非检测目标出现假象的“背景噪音”问题，因而现可在荧光显微镜设备上安装一套“数字成像处理系统”，即把图像信息通过摄像机和电脑的图象数字化处理，使信号反差得以放大增强，对假象削弱或消除，从而明显提高检测的准确率和灵敏度。,激光扫描共焦显微镜Laser scanning confocal microscope,激光扫描共焦显微镜的物镜和聚光镜是聚焦于同一焦点之上，故能排除焦平面以外荧光的干扰，因此其分辨率比普通荧光显微镜要提高1.41.7倍，并还能 以“光学切片”方式去观察较厚样品之中的内部精细结构。,（二）电子显微镜,1.透射电镜 transmission electron m
8、icroscope,TEM透射电镜的成像光路图，与光镜的基本类似。只不过是以电子枪所发射的高速电子流代替了照明光源，又以三组电磁线圈所构成的磁透镜代替了玻璃制成的聚光镜、物镜和目镜。第一组磁透镜能将电子流聚集到样品上（故称为会聚镜），第二组磁透镜能使穿透过样品的电子射线折射形成初级放大象（称为物镜），而第三组磁透镜则是通过第一、第二中间镜和投影镜进行连续三次的再放大，最终投射到荧光屏上，使电子图象转变成可见的光学图象。,特点：（1）照明光源不同；（2）放大倍数的调节方式不同。是依靠改变磁透镜的激磁电流强度来调节放大倍数的。也就是说，电流强度的变化引起了磁场强度的改变，而磁场强度的变化又使电子射
9、线的折射程度发生改变，因而放大倍数即随之出现变化。（3）具有高压稳压系统。电子流的发射速度及波长皆取决于电压的高低，通常透射电镜的电压达几万十几万伏的高压。,（4）有高度真空的工作系统。因为高速运动的电子流如果与空气中的微粒和分子碰撞就会改变它的发射方向，导致成像模糊。故要求电镜内的工作系统（包括样品室）都必须保持高度真空状态，并且样品都必须脱水。因此说，透射电镜不能用来观察活的样品。（5）样品厚度必须 900（即 90 nm，0.09m）。这是因为电子穿透能力有限，样品过厚则成象不清晰，并且高速穿透的电子会产生热量，能将厚样品烧出白斑。所以透射电镜观察的样品标本必须超薄切片（厚度为400-5
10、00），却不能用普通光镜下观察的石蜡切片（厚度为2-7m）标本。,（6）标本染色技术不同。电镜标本不是象光镜标本那样染上各种颜色，而是使须观察的结构与背景之间，黑白对比分明，反差增强。所以电镜标本的染色剂大多是重金属盐类。染色方法有正染、负染两大类。正染常采用醋酸铀或柠檬酸铅染色，使得被观察的结构偏暗，背景较亮。负染则是使用磷钨酸染色，使得背景较暗，而观察的结构显得明亮突出。（7）特殊的投影技术（真空喷镀法）。是对电镜标本的表面处理技术，即以真空喷镀仪在真空条件下，将金、铂等金属微粒倾斜地喷向标本，使其朝向发射源的表面所沉积的金属微粒多于背面。因而电镜观察时感觉反差极强，具立体感。,（8）冰冻
11、蚀刻（或冰冻断裂）技术是研究细胞各种膜相结构的处理方法。先将样品放入-190低温下迅速冰冻，再在真空中用冷却刀切割撕裂，随后上升温度，让冰在真空中升华成水汽跑掉，断裂面的细微结构则暴露出来，再用真空喷镀仪在断面上喷一层碳膜或者铂碳膜（称为“表面复型膜”）。然后拿出真空之外，用有机溶剂将样品溶解掉，置“表面复型膜”于铜网上，即可上电镜观察了。因此，电镜下看到的实际上已不是样品本身，而是样品某一断裂面的“人工复制品”。这是因为人为的这种表面复型膜能比生物样品本身具有更强的电子反差性能，能够以富有立体感的浮雕形式精细地反映出某一断裂面的细微结构。,对于冰冻蚀刻处理的生物膜各个面，国际上统一规定命名称
12、号为：“PS”代表面向细胞质基质的表面（protoplasmic surface）；“ES”代表背向细胞质基质的表面（extrocytoplasmic surface），“PF”代表靠近细胞质基质的半边膜撕裂面（protoplasmic face）；“EF”代表背离细胞质基质的半边膜撕裂面（extrocytoplasmic face）。,2、扫描电镜scanning electron microscope SEM,工作原理不同于透射电镜。是以电子束在样品表面扫描，用闪烁器收集样品表面散射回来的二次电子信号，再经放大，最后在荧光屏上显示出图象。特点：不需要经过复杂处理，即可观察标本的原始外表面。
13、,优点：可观察较大、较厚的样品；景深大（景深聚焦后能清晰看到物象的前后距离范围），所以图像是十分逼真的三维立体形象；其放大倍数是从20 20万倍的连续变倍，不须重复多次对焦，故对观察研究很方便；样品可在样品室内做多方位的水平移动和旋转转动，便于从各个角度来观察样品的全貌。缺点：分辨力不太高，仅0.7-3 nm；不能观察样品内部。,（三）扫描隧道显微镜scanning tunneling microscope，STM,是新型探测样品外表的纳米级微观形貌的高级仪器，具有三维立体扫描物体表面的原子尺度高分辨能力，并能在常规大气或液体条件下观测样品，无须强求真空环境条件，也不采用高能电子流去轰击样品，
14、故有利于观察样品的真实自然形态。这是目前开展纳米结构生物学研究的重要技术，已被应用于直接观察DNA分子、RNA分子、蛋白质分子及生物体的微观精细结构。,几种微观检测仪器的性能比较 扫描电镜 透射电镜 X-衍射 核磁共振 扫描隧道显微镜 原子力显微镜 SEM TEM X-ray NMR STM AFM分辨率nm 3 0.2 0.1 0.1 0.1 0.1工作环境 真空 真空-溶液 多种环境 多种环境样品制备 容易 较复杂 困难 一般 简单 简单观察范围 nm以上 3nm-nm-m nm-m成象机制 简单 简单 复杂 复杂 一般 简单Nuclear magnetic resonance 核磁共振A
15、tomic Force Microscope 原子力显微镜,二、细胞生化分析,（一）组织化学和细胞化学染色法histochemical and cytochemical staining methods 利用某种显色剂能与某种细胞成分特异性相结合，显示特定颜色的原理，对组织和细胞内某些成分进行定位和定性分析的研究方法。可对无机盐、蛋白质、醛类、碳水化合物、脂类、核酸和酶类等多种成分检测鉴定。,例：孚尔根反应（Feulgen）特定显示DNA的细胞化学技术。其原理是，经稀盐酸水解打开DNA上嘌呤碱与脱氧核糖之间的连接键，暴露出醛基，由于自由醛基能与无色品红（希夫试剂）反应形成紫红色的化合物，据此可
16、对细胞内的DNA进行定性和定位检测。此外，由于其染色的深度与DNA浓度是成正比关系，所以当孚尔根法染色后，再用显微分光度计测量，即可对细胞内的DNA含量进行定量测定。,再例：Comori法显示酸性磷酸酶：磷酸脂 磷酸根 磷酸铅 硫化铅（棕黑色）,酶解,pH5.0,铅盐,硫化铵,（二）免疫细胞化学immunocytochemistry,依据抗体能与对应的抗原自行相互识别结合的免疫学原理，来检测特定蛋白质在细胞内的分布状况。首先将某种抗体联结上标记物（光镜观察用的标记物是荧光素或酶；而电镜观察用的标记物是胶体金），再与组织或细胞样品混合反应，随后在光镜或者电镜下检查标记物沉积的部位，即对抗原进行定
17、位测定。如果标记物是荧光素，则是在荧光显微镜下检查荧光信号部位，以显示抗原所存在的位置。,抗体与抗原结合的方式分直接法和间接法两种，直接法是先制备抗血清，将抗体与荧光素结合，然后再用其浸染样品，待荧光抗体与抗原结合反应后，再在荧光显微镜下鉴别抗原的存在部位。而间接法的不同之处是在抗原抗体初级反应的基础上，再增加一种能同初级抗体发生结合反应的次级抗体（即“抗抗体”），从而使初级反应效果得到“放大”，以增强分析观察的灵敏性和准确性。如果与抗体联结的标记物是酶，则可采用与酶的底物反应，产生呈某种颜色的沉积物，再依据这种特定颜色沉积物的出现位置，来对探测物质的定性定位分析，这被称为酶标抗体法。例如，辣
18、根过氧化物酶 是常被用作标记物的酶，该酶可催化过氧化氢与二氨基联苯胺 发生氧化反应，形成棕色的沉积物，从而便于在光镜或电镜下进行观察分析。,(三)显微分光光度测定技术microspectrophotometry,细胞内各种化学成分对光的吸收均有专一的波段，例如核酸是吸收紫外光260nm光波，氨基酸则吸收280nm光波。此外，有些细胞成分经过细胞化学染色技术处理后，也对可见光波有特定的吸收光谱。依据这种特性，运用显微分光光度计可对某些细胞成分进行定位和定量分析。目前，最先进的显微光谱分析仪器是流式细胞仪，它是采用激光作为光谱测量光源，还采用了细胞流动系统和电脑数据处理系统，所以，一秒钟可测定50
19、00个细胞的多种参数，例如 DNA含量、蛋白质含量、细胞体积和直径等等,此外还可将含不同成分的细胞迅速大量分离。,（四）显微放射自显影microradiography,依据照相原理，利用放射性同位素所发射出来的射线（主要是粒子），使感光材料（照相乳胶）上产生潜影（此过程称为“曝光”，即让照相乳胶上的溴化银还原成银），再经过显影和定影，即可观察到用同位素标记的某种物质在标本中的位置和数量。常用的放射性同位素有 3H、14C、32P和35S等。例如：用3H标记的胸腺嘧啶核苷可测定DNA的合成代谢；用3H标记的尿嘧啶核苷可研究RNA的合成代谢，用14C或35S标记可研究蛋白质的合成。由于此技术灵敏度
20、很高，是对生物大分子进行精细定位的有效方法。,其操作过程：（1）同位素标记实验样品；（2）样品标本制备（包括固定、包埋、切片或 超薄切片或滴片）；（3）涂布乳胶（在暗室）；（4）曝光（自显影，在暗盒内）；（5）显影、定影、清洗；（6）标本染色；（7）在光镜下或电镜下观察。,由于放射性同位素标记对人不安全，且有操作步骤复杂、费时费工的缺点，因此目前在基因定位研究方面大多改用非放射性标记方式例如应用生物素标记或地高辛标记来替代同位素，在生物素或地高辛上联结荧光素或酶，再以荧光显微镜或酶联反应来检测，效果亦同样很好。,（五）超速离心技术ultracentrifugation,是细胞生化分析研究的基础
21、实验方法，是分离纯化细胞亚微结构和生物大分子的重要技术手段。超离心可达几万几十万转/分（g）的高转速，各种细胞亚微颗粒在离心场中的沉降速率不一样，衡量各种物质颗粒在单位强度离心场中沉降速率的量度，称为沉降系数。沉降系数的单位叫斯维伯格单位 Svedberg unit，简称“S”，各种细胞亚微结构和蛋白质颗粒都具有各自固定的S值。,1.差速离心differential centrifugation 是利用不同离心速度所产生的离心力差别，可将大小不同的亚微结构颗粒分离开。此法适用于分离沉降速率差别较大的亚微结构颗粒，而对于差别较小的则应采用密度梯度离心法。,2、密度梯度离心 density gra
22、dient centrifugation 首先将离心溶液制备成连续或不连续增高的密度梯度，其密度变化的范围与待分离颗粒的密度大致相当，然后通过一段时间离心操作后，不同密度的颗粒就会分别集中于与其相应的密度梯度区带之中，而得以分离。,常用的密度梯度离心方法有两种：（1）蔗糖密度梯度离心。即事先配制一系列不同浓度的蔗糖溶液，分先后顺序缓缓注入离心管，制成自下而上递减的浓度梯度（5 20%或 10 60%）。再将待分离的颗粒混合悬液加在最上面。然后在离心过程中，这些颗粒会在蔗糖浓度梯度中徐徐沉降，当沉降达到平衡状态时，不同类型的颗粒便会分别集中在与其对应的浓度区带之中。最后掌握在颗粒区带抵达管底前停
23、止离心，按区带分别收集样品，进行分析。,（2）氯化铯密度梯度离心。氯化铯的密度梯度不需事先制备，而是在离心场中会自行形成稳定的连续梯度。即在离心操作前，将待分离的生物大分子悬液加入氯化铯溶液中。离心时，当氯化铯形成稳定梯度后，各种生物大分子便会自动向梯度中相当于本身浮力密度的位置移动，最终每种类型的大分子在等密点形成一条狭窄的带。因此这种方法又被称为等密度梯度离心。,三、细胞生理测定,（一）细胞膜电位测定细胞膜内外两侧的阳离子浓度不同，通常是外高内低（外正内负），造成细胞膜内外具有一定的电位差，被称为膜电位。膜电位的变化能反映细生理变化，譬如当神经兴奋信号传导时，或肌肉收缩运动时，膜电位都会发
24、生显著变化。测量膜电位是采用微电极。微电极是由毛细玻璃管所构成，管内注满KCl溶液，插入一根银丝，银丝用导线与电位计或示波器连接。测量时使用一对微电极，一个插入细胞内，一个插在细胞外的介质中，即可以电位计或示波器来显示和记录细胞内外的电位变化。,（二）细胞电泳cell electrophoresis细胞表面的分子具有电荷基团，因此在外加电场作用下，悬液中的细胞都会朝正极泳动，这称为细胞电泳。不同类型的细胞，或者处于不同生理状态下的同种细胞，由于其细胞表面的电荷量有所不同，所以在同电场中的电泳速度不同；而在恒定条件下，同种细胞的电泳速度是相对稳定的。所以细胞电泳技术对研究细胞癌变有重要作用。此外
25、，细胞电泳装置还能用来分离不同种类的活细胞。,四、其它实验技术,（一）细胞培养cell culture胚胎培养离体组织培养细胞培养，细胞培养是细胞生物学的基础研究技术，同时在医学、农业等领域都有广阔的应用价值。原理：将生物体的某一类群细胞，甚至单个细胞分离出来，放入具有适合细胞生活条件的培养器皿中，维持并促进其正常生长和繁殖。,技术环节：细胞分离、培养条件和培养基。细胞分离方式机械分割、酶解处理，动物组织细胞通常以胰蛋白酶消化细胞间的联结，植物组织细胞则是以纤维素酶和果胶酶消化细胞壁等联结物质。细胞培养条件要尽可能与生物体内生理状况一致，主要是培养温度、pH值和渗透压等。此外，细胞培养还必须保
26、持严格无菌，因为离体细胞已脱离了生物体免疫系统的保护，是极易受细菌、真菌等微生物的污染侵害。培养基的选择是决定培养成败的技术关键，培养基主要成分包括：各种氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐以及能促进细胞生长分裂的生长素、细胞激动素等，动物细胞培养基中还需要增添胎牛血清。,细胞培养方式：培养瓶培养、液体悬浮培养、平板培养、回转玻璃管培养等。细胞培养的名词概念：（1）传代：当培养细胞长满一层后，必须分瓶接种再培养。该人为操作称为传代。（2）原代培养：指从组织中分离出来，连续培养十代之内的细胞培养。（3）继代培养：连续培养十代以后的操作。（4）细胞系cell line：从原代培养物中接种得来的一群不
27、均一的细胞，可长期连续传代。,（5）细胞株cell strain：是从原代培养物或细胞系中筛选获得的具有某种特殊遗传特性、生化特性和特异标记的培养细胞群。细胞系一般都是转化细胞，可以无限传代，长期繁延下去（连续细胞系）。而细胞株却与细胞系不同，其生存期是有限的（有限细胞系）。细胞（株）系是供细胞遗传学、细胞生理学、免疫病理学研究的好实验材料。例如 HeLa 细胞系是 1953 年取自一位美国黑人妇女的子宫颈瘤上皮细胞，现在全世界仍采用该细胞系做人体细胞生化等研究的典型材料;此外,著名的动物细胞试验材料-CHO 细胞系（chinese hamster ovary)是取自中国仓鼠卵巢组织的细胞系。
28、,（6）克隆 clone即无性繁殖系。目前有植物克隆、动物克隆、微生物克隆、胚胎克隆、细胞克隆和分子克隆之分。细胞克隆即指由单个细胞培养繁殖而成的一群遗传性状完全相同的细胞群体。如果一个细胞株是通过克隆形成法产生的，那么这个细胞株亦可称为一个克隆。,（二）细胞显微操作技术,运用显微操作器可对细胞进行微量注射、细胞核移植、膜电位测定、胚胎切割和基因转移等多种细胞生物学研究工作。显微操作器的主体部分是倒置显微镜加上显微操纵仪组成，显微操纵仪是能精密调节的微动机械装置，可以在光镜视野下控制微型解剖针、微电极以及毛细吸管等器械对细胞进行显微手术，先进的显微操作器还装有闭路电视、电脑和示波器，可以边操作
29、，边监视细胞内的变化情况。我国著名学者童第周教授1963年就应用显微操作器开展细胞核移植,研究动物细胞的核质关系。而1997年“多莉”克隆羊即是由显微操作进行细胞核移植的结果。,（三）细胞融合cell fusion,是有广泛实用价值的细胞工程技术。即以融合因子诱导两个或两个以上的细胞融合成一体，形成新类型的杂种细胞。细胞杂交不但可以在不同种或者不同属生物的细胞之间进行，而且还可以在亲缘差距极大的细胞之间进行，例如人的成纤维细胞与小鼠肿瘤细胞杂交，胡萝卜的原生质体与蟾蜍体细胞杂交等等。,诱导细胞杂交的融合因子：（1）灭活的病毒（例如仙台病毒、新城鸡瘟病毒、疱疹病毒）；（2）聚乙二醇PEG、溶血卵磷脂；（3）高pH值、高钙离子（植物细胞融合）；（4）电脉冲细胞融合 细胞融合技术被广泛应用于人类基因定位研究、细胞分裂周期调控研究及肿瘤免疫学等研究，例如“单克隆抗体”就是应用细胞融合技术与免疫学技术巧妙结合的科技产物。,（四）细胞拆合应用某些物理方法（例如显微操作核移植和去核）或化学方法（例如以细胞松弛素B 处理后离心去核），把细胞拆开成为两部分核体（karyoplast）和胞质体（cytoplast），再把来自不同种类细胞的这两部分融合组成“重组细胞”。可适用于基础理论研究和应用基础研究。,
