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1、革兰氏染色法,2009年8月一厂品控,目的要求,学习并掌握革兰氏染色的方法,实验材料,菌种：枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金 黄色葡萄球菌。染料：草酸铵结晶紫液、革兰氏碘 液、95%乙醇、番红液（沙皇复染液）其他：显微镜、载玻片、接种环、酒 精灯、无菌生理盐水、香柏油、二甲 苯等。,基本原理,革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法。1884年由丹麦医师Gram创立。,实验内容,对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡 萄球菌分别进行革兰氏染色。对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌混合涂片进 行革兰氏染色。,经碱性染料结晶紫染色经碘液媒染用酒精脱色有的细菌紫色不被脱去（G+），有的可被脱去（G-）,步骤,脱色后
2、再用一种红色染料，如碱性番红等进行复染。阳性菌仍带紫色，阴性菌则被染上红色。有芽孢的杆菌和绝大多数球菌，以及所有的放线菌和真菌都成革兰氏正反应（G+）弧菌，螺旋体和大多数致病性的无芽孢杆菌都成负反应（G-）,革兰式阳性菌和革兰氏阴性菌在化学组成和生理性质上有很多差别，染色反应不一样。革兰氏阳性菌体内含有特殊的核蛋白质镁盐与多糖的复合物，它与碘和结晶紫的复合物结合很牢，不易脱色，阴性菌复合物结合程度低，吸附染料差，易脱色，这是染色反应的主要依据。,与细菌细胞壁的化学组成及结构有关革兰氏阳性细菌由于细胞壁肽聚糖含量高，脂类含量低，乙醇处理使细胞壁脱水，肽聚糖层孔径变小，通透性降低，结晶紫碘复合物被
3、保留在细胞内，细胞不被脱色。,革兰氏阴性菌细胞壁脂类物质含量高，肽聚糖含量较低，乙醇溶解了脂类物质，使细胞壁通透性增加，结晶紫碘复合物易被抽出，于是被脱色。,阳性菌菌体等电点较阴性菌低，在相同pH条件下进行染色，阳性菌吸附碱性染料较多，因此不易脱去，阴性菌则相反。所以染色时的条件要严格控制。,方法与步骤,涂片干燥固定草酸铵结晶紫染色（1min）水洗路哥氏碘液媒染（1min）水洗95%乙醇脱色（30s）水洗番红复染（1min）水洗干燥镜检。,制 片,取一片载玻片，在中央滴一小滴生理盐水，用接种环以无菌操作，从单个菌落中挑取少量的菌于生理盐水滴中，混匀并涂成薄膜,干 燥,涂面朝上，瞬间通过火焰2-
4、3次，使生理盐水完全干。,初 染,在菌膜上滴加结晶紫染色1分钟，用蒸馏水进行冲洗（不要正对着菌膜冲，以免将细菌冲掉），至无紫色液体流出。,固 定,用碘液冲去残水，并用碘液覆盖菌膜1分钟，对结晶紫染色进行巩固，之后用蒸馏水对其进行冲洗，至无颜色流出为止。,脱 色,将玻片倾斜，用滴管吸95%的酒精进行冲洗脱色30秒，立即用蒸馏水冲洗。,复 染,用沙皇复染液对其进行复染1分钟，用蒸馏水冲洗。,镜 检,用滤纸将水吸干，滴1滴香柏油在菌膜中央，用油镜观察。,严格掌握乙醇脱色程度，如脱色过度，则阳性菌被误染为阴性菌；而脱色不够时，阴性菌被误染为阳性菌。菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间很长，或已死亡及部分自行溶解了，都常呈阴性反应,关键点,大肠杆菌（G-）,枯草芽孢杆菌（G+）,金黄色葡萄球菌与大肠杆菌,实验思考题,大肠杆菌和枯草芽孢杆菌染色后，是G-还是G+？为什么革兰氏染色所用细菌的菌龄有所要求？你的实验结果与与培训中所述是否一致？如果不一致，试分析原因。,培训师评价单,
