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1、2023/7/1,1,第一章色谱法的基本原理,2023/7/1,2,色谱分析法是用来进行混合物中各组分的分离和分析的一种物理化学分析方法。,1.1 色谱法概述1.1.1 色谱法发展史,固定相,流动相,1,2023/7/1,3,1903年，俄国植物学家Tswett 利用吸附原理分离植物色素而 发明色谱法(chromatography)。1941年Martin A J P和Synge R L M发明液液分配色谱、获1952年 诺贝尔化学奖。1952年Martin A J P和James A T发明气相色谱(gas chromatography,GC)70年代发展了高效液相色谱(High-perfo
2、rmance liquid chromaotgraphy,HPLC)成为重要分离分析技术 80年代Jorgenson J W等的研究工作推动了高效毛细管电泳(High-performance capillary electrophoresis,HPCE)高速发展,2,2023/7/1,4,1.1.2 色谱法分类1、按两相所处的状态分类气相色谱-用气体作流动相液相色谱-用液体作流动相 由于固定相可分为固体吸附剂和涂在固体担体上或毛细管内壁上的液体固定相，故可将色谱法分为下述四类：,3,2023/7/1,5,2、按固定相形状分类柱色谱 固定相装在柱管内。它又可分为填充柱色谱和空心毛细管色谱。GC
3、填充柱:长110 m，24 mm空心毛细管:长10100 m，0.10.5 mmLC:长0.10.5 m，46 mm纸色谱 用滤纸作固定相，试样溶液在纸上进行展开、分离。薄层色谱 将固定相研磨成粉末，再压成薄膜或涂成薄膜。样品的分离形式类似纸色谱。(纸色谱和薄层色谱又统称作平板色谱),4,2023/7/1,6,3、按分离过程的物理化学原理分类 吸附色谱(LS，GS)利用吸附剂表面对不同组分物理吸附性能的差异进行分离。分配色谱(LL，GL)利用不同组分在两相中分配系数的不同进行分离。离子交换色谱(LS)利用组分离子与离子交换剂的交换能力不同进行分离。空间排阻色谱(LS)用多孔物质对不同大小分子的
4、阻碍作用进行分离。,5,2023/7/1,7,1.2 色谱分离原理,1.2.1 分配系数和分配比,1.分配系数,s：固定相m：流动相,2.分配比(保留因子),定义：在一定的温度、压力下，组分在气液两相间达平衡时，分配在液相中的质量与分配在气相中的质量之比。即,6,2023/7/1,8,k:随K和流动相、固定相体积的变化而变化，而K是由组分及固定液的热力学性质决定的。,：相比 Vm：色谱柱中流动相体积，Vs：色谱柱中固定相体积,7,2023/7/1,9,1.2.2 分离原理,8,2023/7/1,10,1.3 色谱流出曲线,、色谱峰,流出曲线（色谱图）：电信号强度随时间变化曲线色谱峰：流出曲线上
5、突起部分,9,2023/7/1,11,1.峰高 色谱峰顶点与基线之间的距离，以h表示，如图中AB 2标准偏差 0.607h处，拐点处，峰宽正好为2 3峰面积A A1.065hY1/2 4半峰宽Y1/2 Y1/2=2.354 5峰底宽 Y=4，拐点作切线与基线相交，相交两点，两点间距 离为峰底宽，如图中AB。、Y1/2、Y统称为区域宽度,10,2023/7/1,12,保留值是用来描述待测试样中各组分在色谱柱中滞留情况的物理量，通常用距离或将各组分带出色谱柱所需的载气体积（或时间）表示。在一定的固定相和操作条件下，任何一种物质都有一个固定的保留值，故组分的保留值可用于该组分的定性鉴定。1死时间tM
6、 不被固定相吸附或溶解的组分从进样开始到柱后出现响应信号极大值时所需时间。对于气相色谱，常把空气（热导检测器）和甲烷（氢火焰离子化检测器）从进样到出峰的时间称为死时间。,1.3.2 保留值,11,2023/7/1,13,2保留时间tR 试样从进样开始到柱后出现峰极大点时所经历的时间，称为保留时间，如图 OB。它相应于样品到达柱末端的检测器所需的时间。3.调整保留时间 扣除死时间后的保留时间。tR=tRtM 4.流动相的流速,Vc=qct,12,2023/7/1,14,5死体积VM 不被保留的组分，即分配色谱中K=0的组分，可由死时间来确定。VM=tM qV,c 6保留体积VR 从进样开始到柱后
7、出现待测组分响应信号极大值时所通过的载气体积。VR=tRqV,c,13,2023/7/1,15,7调整保留体积VR 指扣除死体积后的保留体积。VR=VRVM 8相对保留值r2,1 指组分2的调整保留值与组分1的调整保留值之比，是一个无因次量，只和柱温与固定相性质有关，故其可以作为一个定性指标。r2,1也可用表示，即，也叫做选择因子。,14,2023/7/1,16,9保留值与保留因子 间的关系,15,2023/7/1,17,16,2023/7/1,18,从色谱流出曲线可以得到以下一些信息：a样品所含最少组分(峰个数)b根据色谱峰的保留值可以进行定性分析c根据色谱峰的面积或峰高可以进行定量分析d根
8、据色谱峰的位置和区域宽度可对色谱柱效能进行评价,17,2023/7/1,19,1.4 塔板理论,1.4.1 塔板理论的假设 在自然科学上，科学理论：,塔板理论思路源于精馏塔,18,2023/7/1,20,塔板理论的假设：1.柱分成n段，n为理论塔板数，每段高为H，H为塔板高度，柱长为L，则n=L/H2.所有组分开始都加在第零号塔板上。3.在每块塔板上被测物在气液间的平衡是瞬间建立的。4.载气是以脉冲式(塞子式)进入色谱柱进行冲洗的，每次恰好为一个塔板体积V。5.在所有塔板上，同一组分的分配系数为常数，即和组分的量无关。6.沿色谱柱方向不存在塔板与塔板间被测物的纵向扩散。,19,2023/7/1
9、,21,假定：K=1 Vs/Vm=1 k=1 n=5 进样量 m=1,20,2023/7/1,22,被测物流出色谱柱时流动相中被测物浓度随体积(或时间)的变化曲线。,21,2023/7/1,23,这一理论得到结果1分布有一最大，两边逐渐减小2最大及整个分布曲线向后推移3流出曲线方程(也称塔板理论方程)，即数学表达式：,C：不同流出体积时的组分浓度m：进样量 VR：保留体积n：塔板数 V：流出体积,22,2023/7/1,24,理论塔板数与色谱参数之间的关系为：,单位柱长的塔板数越多，表明柱效越高。用不同物质计算可得到不同的理论塔板数。,23,2023/7/1,25,有效塔板数和有效塔板高度,组
10、分在t0时间内不参与柱内分配，需引入有效塔板数和有效塔板高度：,24,2023/7/1,26,塔板理论的成功与局限1成功 导出流出曲线数学表达式(模型)解释了流出曲线形状、浓度极大点 提出了评价柱效的参数(n)及其计算式2局限 仅考虑了热力学因素，没有考虑动力学因素。不能说明影响柱效的原因及谱带扩张的原理 不能说明流速对柱效的影响，实验测得流速不同时n 和H不同。,25,1956年荷兰学者范弟姆特(Van Deemter)提出了色谱过程的动力学理论，导出了塔板高度 H与载气线速度u 的关系式：,1.5 速率理论,1.5.1 气相色谱法,26,2023/7/1,28,A涡流扩散项,A=2dp d
11、p：固定相的平均颗粒直径：固定相的填充不均匀因子,影响A的因素：A与填充物颗粒大小dP和填充均匀性(取决于填充物颗粒的大小分布和装柱情况)有关,与载气性质、线速和组分无关。减小涡流扩散提高柱效的有效途径：使用适当的粒度且颗粒均匀的担体，并尽量填充均匀。,27,2023/7/1,29,B/u 分子扩散项,B=2Dg：弯曲因子，填充柱色谱，1。Dg：试样组分分子在气相中的扩散系数（cm2s-1）分子量大的组分Dg小，Dg反比于载气密度(分子量)的平方根,故采用分子量较大的载气可使B项降低。分子扩散项还与弯曲因子有关。填充柱=0.50.7 毛细管柱=1.0保留时间长，分子扩散项对色谱峰变宽的影响显著
12、。,28,2023/7/1,30,C u 传质阻力项,传质阻力包括气相传质阻力Cg和液相传质阻力CL即：C=（Cg+Cl）,k为分配比 dp:填充物(固定相)直径平均值,气相传质阻力项与填充物粒度的平方成正比，与组分在载气流中的扩散系数成反比，因此采用粒度小的填充物和分子量小的气体作载气可使Cg减小，从而提高柱效。,29,2023/7/1,31,液相传质过程：指待测试样组分从固定相的气液界面移动到液相内部，发生质量交换以达到分配平衡，然后又返回气液界面的传质过程。,Cl：液相传质阻力系数 df：固定相液膜厚度Dl：组分在液相中的扩散系数(m2/s),减小液膜厚度df，增大组分在液相中的扩散系数
13、Dl，均可提高柱效。,30,2023/7/1,32,31,2023/7/1,33,范氏方程说明了在色谱分离条件的选择中，填充 均匀程度、填充物的粒度、流动相的种类及流速、固定相的液膜厚度等对柱效和峰展宽的影响,32,2023/7/1,34,33,2023/7/1,35,2分子扩散项(纵向扩散项)B/u BCdDm Cd：常数 Dm：分子在液相中扩散系数一般Dg101cm2/s，Dm105cm2/s，所以对于液相色谱，这一项可忽略。,34,1.5.2 液相色谱法,1涡流扩散项A A2dp：填充不规则因子 dp：填充物平均直径,2023/7/1,36,3传质阻力项Cu,固定相传质阻力项,35,20
14、23/7/1,37,36,2023/7/1,38,1.6 分离度1.6.1 定义 分离度Rs是相邻两组分色谱峰保留值之差与两个组分色谱峰峰底宽度总和的一半的比值。,Y1，Y 2：两组分色谱峰峰底宽度,：两组分保留时间,37,2023/7/1,39,分离度R是既能反映柱效率又能反映选择性的指标，称总分离效能指标。分离度又叫分辨率,R=0.8：两峰的分离程度可达89%，有部分重叠；R=1：分离程度98%；R=1.5：达99.7%（相邻两峰完全分离的标准）。,38,2023/7/1,40,分离方程,39,2023/7/1,41,1.柱效的影响 分离度与柱效因子n的平方根成正比，一定时，增加柱长以增加
15、柱效n，可提高分离度，但组分保留时间增加且峰扩展，分析时间长。增加n值得另一办法是减小柱的H值,2.分配比的影响 柱容量项k/(k+1)值随k的值增大而增加，分离度随之增加，但当k10时，对Rs改进已不明显，一般控制在110之间。,1.6.3 影响分离度的因素,40,2023/7/1,42,2.选择性的影响 增大 是提高分离度的最有效方法。在相同分离度下当增加一倍，需要的n有效 减小10000倍。增大 的最有效方法是选择合适的固定相。,41,2023/7/1,43,1.6.1 色谱定性鉴定方法,1.利用纯物质定性的方法 利用保留值定性：通过对比试样中具有与纯物质相同保留值的色谱峰，来确定试样中
16、是否含有该物质及在色谱图中的位置。利用加入法定性：将纯物质加入到试样中，观察各组分色谱峰的相对变化。,1.6 定性和定量分析,42,与其他分析仪器联用的定性方法,小型化的台式色质谱联用仪（GC-MS；LC-MS）色谱-红外光谱仪联用仪；组分的结构鉴定,43,2023/7/1,45,1.6.2 色谱定量分析方法,1.峰面积的测量（1）峰高（h）乘半峰宽（Y 1/2）法：近似将色谱峰当作等腰三角形。此法算出的面积是实际峰面积的0.94倍：A=1.065 hY1/2（2）峰高乘平均峰宽法：当峰形不对称时，可在峰高0.15和0.85处分别测定峰宽，由下式计算峰面积：A=h（Y 0.15+Y 0.85）/2,44,2023/7/1,46,2 定量校正因子2.1 绝对校正因子,由于受到仪器及操作条件的影响程度很大，实际定量分析时，基本上不使用,45,2023/7/1,47,2.2 相对校正因子,相对响应值（灵敏度）,46,2023/7/1,48,1.6.3 常用的几种定量方法（1）归一化法：,特点及要求：归一化法简便、准确；进样量的准确性和操作条件的变动对测定结果影响不大；仅适用于试样中所有组分全出峰的情况。,47,48,2023/7/1,50,（2）外标法,外标法也称为标准曲线法。,49,50,2023/7/1,52,三种定量方法的对比,51,
