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1、细菌鉴定技术,常用细菌生化反应,糖发酵试验吲哚试验（靛基质试验）甲基红试验 V-P（Voges-Proskauer）试验 枸橼酸盐（或柠檬酸盐）利用试验克氏双糖铁（KIA）复合试验 动力、吲哚及脲酶（MIU）复合试验,1.糖发酵试验,【原理】：各种细菌含有不同的分解糖（苷、醇）的酶，对糖（苷、醇）分解能力也各不相同，有的不分解，有的分解后仅产酸，有的分解后产酸产气，故可用来鉴别细菌。【方法】：将大肠埃希菌和伤寒沙门菌分别接种葡萄糖、乳糖发酵管，35C培养18-24h 观察结果。,1.糖发酵试验,【结果】：首先确定细菌是否生长，细菌生长者培养基呈混浊状：1）不分解糖，培养基顔色与接种前无变化，以
2、“-”表示；2）分解糖产酸不产气，培养基由紫色变为黄色，以“+”表示；3）分解糖产酸产气，除培养基顔色变化外，倒管中还有气泡，以“”表示。大肠埃希菌分解葡萄糖和乳糖产酸产气，伤寒沙门菌分解葡萄糖产酸不产气，不分解乳糖。,2.吲哚试验（靛基质试验）,【原理】：有些细菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸产生吲哚，与吲哚试剂形成红色化合物。【方法】：大肠埃希菌和伤寒沙门菌分别接种于蛋白胨水培养基中，35C18-24h后，加入吲哚试剂数滴，静置分层，观察结果。【结果】：在培养物液面上层呈玫瑰红色为阳性，不变色者为阴性。大肠埃希菌为阳性，伤寒沙门菌为阴性。,3.甲基红试验,【原理】：某些细菌分解葡萄糖
3、产生丙酮酸，丙酮酸可进一步分解为甲酸、乙酸等酸性物质，故培养基pH 在4.5以下，加入甲基红指示剂后呈红色（阳性）；有些细菌分解葡萄糖产生的酸进一步化为醇、酮等非酸性物质，使培养基pH在6.2以上，加入甲基红指示剂后呈黄色（阴性）。【方法】：大肠埃希菌和产气肠杆菌分别接种葡萄糖蛋白胨水培养基中，35C18-24h，加入甲基红指示剂2-3滴观察结果。【结果】：红色为阳性，黄色为阴性。大肠埃希菌为阳性，产气肠杆菌为阴性。,+,4.V-P（Voges-Proskauer）试验,【原理】：某些细菌分解葡萄糖生成丙酮酸，进一步脱羧生成乙酰甲基甲醇，在碱性环境下被氧化成二乙酰，后者与蛋白胨中的精氨酸所含的
4、胍基起作用，生成红色胍缩二乙酰，为VP试验阳性。若培养基中胍基含量少，加入少量含胍基的化合物如肌酐，以加速其反应。【方法】：大肠埃希菌和产气肠杆菌分别接种于葡萄糖蛋白胨水中，35C，24-48h，加入VP试剂甲液和乙液各1滴，充分摇动，观察。【结果】：红色为阳性，若为阴性应再培养4h观察，仍无红色者为阴性。大肠埃希菌阴性，产气肠杆菌阳性。,+,5.枸橼酸盐（或柠檬酸盐）利用试验,【原理】：当细菌可以利用铵盐作为唯一氮源，同时柠檬酸盐为惟一碳源时，可在柠檬酸盐培养基上生长，分解柠檬酸盐为碳酸盐，使培养基变碱，指示剂溴麝香草酚蓝由绿色变为深蓝色为阳性，培养基不变色（绿色）为阴性。【方法】：大肠埃希
5、菌和产气肠杆菌分别接种于柠檬酸盐培养基中，35C，24-48h，观察。【结果】：菌苔出现，培养基变为深蓝色为阳性。细菌不能生长，培养基不变色（绿色）为阴性。产气肠肝菌为阳性，大肠埃希菌为阴性。,6.克氏双糖铁（KIA）复合试验,【原理】：该培养基用酚红指示剂，在酸性时呈黄色，碱性时呈红色。细菌如能发酵乳糖和葡萄糖而产酸产气，则斜面与底层均呈黄色，且有气泡。如只发酵葡萄糖不发酵乳糖，因葡萄糖含量少，斜面所生的少量酸可因接触空气而氧化挥发，从而使斜面部分保持原来的红色；底层由于是在相对缺氧状态下，细菌发酵葡萄糖所生成的酸类物质不被氧化挥发而保持黄色。如细菌分解蛋白产生硫化氢，则与硫化亚铁作用生成黑
6、色的硫化铁，使培养基变黑。,6.克氏双糖铁（KIA）复合试验,【方法】：将待检菌接种于克氏双糖铁培养基（底层穿刺，上层斜面划线），35C，24h，观察。【结果】：发酵乳糖和葡萄糖产酸产气，则上层和底层均呈黄色且有气泡产生；只发酵葡萄糖而不发酵乳糖，则底层变黄，上层仍为红色。如底层变黑，说明该菌产生硫化氢，生成黑色的硫化铁沉淀。,双糖铁培养基,标准管,痢疾杆菌KA 斜面：K 红色底层：A 黄色,伤寒杆菌KA,大肠杆菌AA,没产气,没产H2S,产H2S,产气,7.动力、吲哚及脲酶（MIU）复合试验,【原理】：培养基为含尿素、蛋白胨的半固体培养基，指示剂为酚红。具色氨酸酶的细菌能分解色氨酸产生吲哚，
7、加入吲哚试剂后，培养基上层的吲哚会变红；具脲酶的细菌能分解尿素产氨，使整个培养基变碱呈红色；有动力的细菌沿穿刺线扩散生长。【方法】：将大肠埃希菌和普通变形杆菌穿刺线接种于MIU培养基，35C，18-24h，观察动力和脲酶反应后，再滴加吲哚试剂。【结果】：扩散生长为动力阳性；滴加吲哚试剂后呈玫瑰红色为阳性；培养基变红脲酶阳性。,大肠埃希菌MIU（）普通变形杆菌MIU（）,M：动力,I：吲哚,U：尿酶,请记住：,大肠埃希菌KIA（AA）MIU（）,上层变黄,下层变黄,产气,没产H2S,大肠埃希菌IMViC试验（）右侧为对照（）,I：吲哚，M：甲基红，Vi：VP，C：枸橼酸盐,伤寒沙门菌KIA（K
8、A）MIU（）,沙门菌IMViC试验（）,志贺菌KIA（K A）MIU（）,志贺菌IMViC试验（）,肺炎克雷伯菌KIA（A A）、MIU（）,肺炎克雷伯菌IMViC试验（）,产气肠杆菌IMViC试验（）,变形杆菌KIA（K A+）MIU（+/-+）,血浆凝固酶试验：1）原理：金黄色葡萄球菌能产生结合型血浆凝固酶（凝聚因子），可使血浆中可溶性的纤维蛋白原变为不溶性的纤维蛋白，附着于细菌表面，在玻片上形成凝块；游离型的血浆凝固酶则可使试管中的血浆发生凝固。金黄色葡萄球菌的凝固酶阳性，表皮葡萄球菌和腐生葡萄球菌的凝固酶阴性。,【原理】氧化酶或称细胞色素氧化酶，是细胞色素呼吸酶系统的终末呼吸酶。作氧
9、化酶试验时，此酶首先使细胞色素C氧化，然后氧化型细胞色素C再使对苯二胺氧化，产生颜色反应。【方法】取滤纸一角，沾取菌落少许，加试剂一滴，阳性者立即粉红色，并于5-10秒内呈现深紫色。,氧化酶试验,铜绿假单胞菌：阳性大肠埃希菌：阴性,【原理】过氧化氢酶可使过氧化氢分解为分子态氧。【方法】滴加3%过氧化氢溶液数滴于玻片上，挑取固体培养基上的菌落少许于过氧化氢溶液，观察结果。【结果】30s内产生大量气泡者为阳性。,过氧化氢酶（触酶）试验,葡萄球菌：阳性链球菌：阴性,【原理】某些细菌能产生尿素酶分解尿素，产氨使培养基变碱。【方法】将被检菌接种尿素培养基，35培养1824h观察结果。阴性时应继续观察4d
10、。【结果】酚红指示剂变红为阳性，不变为阴性。变形杆菌阳性，大肠埃希菌阴性。,尿素酶试验,【原理】当细菌能利用枸橼酸盐作为唯一碳源时，可在枸橼酸盐培养基上生长分解枸橼酸钠，使培养基变碱。【方法】在枸橼酸盐琼脂斜面上浓密划线，接种被检菌，于35培养14d，逐日观察结果。【结果】枸橼酸盐培养基斜面上有细菌生长，培养基变蓝为阳性；无细菌生长、颜色不变（绿色）为阴性。大肠埃希菌：阴性产气肠杆菌：阳性,枸橼酸盐利用试验,涂片,干燥,固定,染色,水洗,镜检,简单染色方法,干燥,初染 将玻片置于玻片搁架上，加草酸铵结晶紫染色液(加量以盖满菌膜为度)，染色1min。倾去染色液，用自来水小心地冲洗。媒染 滴加(L
11、ugol)碘液，染1min，水洗。脱色 滴加95%乙醇，脱色30s立即水洗，以终止脱色。复染 滴加蕃红，染色30s，水洗。最后用吸水纸轻轻吸干。,革兰氏染色,注意：水洗时，不要直接冲洗涂面，而应使水从载玻片的一端流下。水流不宜过急，过大，以免涂片薄膜脱落。,抗酸染色法,分枝杆菌属的细菌（包括结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌等）为抗酸性细菌，一般染色法不易着色，须用抗酸染色法。注意事项涂片要略厚加温染色或延长染色时间，加温时随时补加染色液分枝杆菌呈红色(+)其他细菌和背景为蓝色(-)。,操作过程,取痰液 涂片（略厚）干燥固定 石炭酸复红加温染色810分钟后用3%的盐酸酒精脱色约12分钟，脱色时轻摇玻片，直到涂片颜色脱去为止水洗后，用碱性美蓝复染1分钟水洗，印干 镜检,细菌接种：固体平板培养基 接种方法：分区划线法固体斜面培养基 接种方法：划线法固体高层斜面培养基 接种方法：穿刺划线法半固体培养基 接种方法：穿刺法液体培养基 接种方法：液体接种法,实验内容复习,使用器材,接种环接种针/接种环接种针接种针接种环/接种针,
