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1、AKTA仪器培训及仪器维护管理计划,仪器负责人：程岚军,AKTA仪器,AKTA分类：AKTA Purifier几大层析技术：,柱子信息,AKTApurifier,流路图,Inlet,Pump,压力感应器,混合器,在线滤器,进样阀,色谱柱,紫外检测器,电导检测器,PH计,收集器,仪器系统补充,系统软件：与360、卡巴斯基对仪器系统稳定性有影响。可以用金山词霸或诺顿收集器有时不转问题：使用完之后把感应器归为到中间的自然状态；EP管盖子剪掉；可以换5ml细长的EP管UV汞灯使用：额定为2000h，用了4800h，状态参数还可以，暂时不需更换！（check里面有两个参数可以看出）,压力偏高：在线滤器堵
2、了，更换，用1MNaOH超声；Inlet滤膜堵了，刷子清洗；压力传感器校正；柱子问题，NaOH冲柱子AKTA使用的柱子，当有标记流速箭头的柱子，切记不可反冲！,基线不稳定：柱子底部筛网膜堵了，可以接反压阀解决；溶液配制问题，更换超纯水观察基线是否稳定；紫外流通池脏了，有气泡，用NaOH冲洗。自动编程和数据保存备份。及时备份拷走数据！,分子筛主要根据分子大小；离子交换根据电荷差异大小，电性；疏水层析根据疏水性；反相层析也是根据疏水性，主要分离肽和小分子；亲和层析根据蛋白特异性结合，选择性最高！,凝胶过滤层析技术GF,分子筛主要根据分子大小和形状差异进行分离的一种简单可靠的层析技术。其中填料95%
3、为水，其余为Agarose琼脂糖凝胶。空间排阻原理，大分子先洗出，小分子后洗出。由于蛋白和填料之间可能存在非特异性吸附，所以在流动性中需要加入150mM NaCl。,如何得到满意的结果,使用选择性最高的填料（Superdex 75）：葡聚糖和琼脂糖交联而成；高选择性，高分辨率；速度快，吸附最低，收率高；化学性质稳定；流速快，耐压性能好使用预装柱尽量使用粒径小而均一的填料合理的进样量/柱高（组分离：25%CV，短；精细分离：0.5-5%CV,30-100cm）注意样品黏度降低流速以改善传质速度（通常5-20cm/h）流动相中使用150mM NaCl,亲和层析技术,如酶和底物、抗原和抗体的非常专一
4、的相互作用。将配基固定在填料上，就可以结合相应的生物分子，再采用合适的方法使之解离。,Ni柱纯化,结合缓冲液中低浓度咪唑的作用,金属离子和组氨酸标签的亲和力,Ni2+最常用作纯化His-标记蛋白质Co2+也可以用作纯化His-标记蛋白质-当目标蛋白质和离子的结合希望较弱的时Cu2+和Zn2+最常用作纯化非标记蛋白质-Cu2+可以和某些蛋白质强力结合，并且一些蛋白只能和Cu2+结合-Zn2+和某些蛋白质的结合比较弱（提供更有选择性的洗脱）-Cu2+和Zn2+都可以用作纯化His-标记蛋白质,总结Ni Sepharose,结合载量高，纯化同样的蛋白需要的介质量少，成本低；具有更低的Ni2+脱落保证
5、了多次重复纯化仍能够保持可靠的载量纯化时，结合缓冲液中咪唑浓度推荐用20-40mM，可以进一步优化5mM,补充说明几个标签蛋白的纯化特点,离子交换层析技术,HiTrapTM SP XL;HiTrapTM Q XL,Source基架人工合成的聚苯乙烯/二乙烯苯填料：特点：化学物理稳定性好，高流速，低反压,SepharoseTM填料琼脂糖基架,高分辨率高流速超高高载量高流速,选择缓冲液需要注意的问题,用和离子交换填料带有同样电荷的缓冲液用相同的离子来调节缓冲液的pH（引入其他离子）在添加盐后再调节pH（加盐和不加盐pH变化）在工作温度下调节pH在运行中监测pH和电导 空白运行！,疏水层析,疏水层析
6、是一种液相吸附层析，依据生物分子之间疏水性的差别来进行分离的。,如何优化,选择合适的盐类型和盐浓度，不同盐增强疏水配基和蛋白质之间的相互作用的能力不同。,控制合适的样品和系统温度,仪器维护工作,使用环境对操作环境的要求：室内温度：440度相对湿度：1090输入电压：100240VAC功率：400AV900AV重量：40KG-70KG注意事项：1、主机要有良好的接地；计算机和主机不要用同一电源2、当把主机置于远端控制时，com线不要长于15m,维护每天：,系统（System）：检查系统是否渗漏.如果数天不使用仪器，须用水将系统冲洗干净，并将层析柱和pH计拆下，之后用20%乙醇清洗系统，并用20的
7、乙醇保存所有的流路。系统泵（Pump P-900）:检查系统泵是否渗漏，如果发现泵头发生渗漏，或是流量不准确，则需更换泵头密封圈。更换缓冲液时，需排尽泵头里的残存气泡，否则会影响流速的准确性。,维护每周,缓冲液筛网（Inlet filters）：检查筛网是否很脏，如有必要须更换.在线滤器（On-line filter）：清洗滤器，如有必要须更换滤膜，否则会形成很高的在线压力，损坏层析柱。泵冲洗液（Pump rinsing solution）：更换泵后冲洗液（20%乙醇）。如果冲洗液瓶中液体量增加，说明泵头密封圈渗漏，须更换,维护每三个月,紫外监测仪（Monitor UV-900）：检测光源强度
8、（应大于20）及使用时间（大于4000hr）、光栅翻转时间（大于2000hr）保护光纤，防止折断或扭弯，否则无法采集数据或数据不准在不做柱层析时，注意关掉光源，尽量延长灯的使用寿命和减少光栅的机械磨省。,10ml系统,100ml系统,维护每六个月,Monitor UV-900 清洗UV流通池，如果样品很脏则须更频繁的清洗.Monitor pH/C-900 检查和校正pH计（pH计在不使用时必须保存在下述溶液中：1:1 mixture of pH 4 buffer and 2 M KNO3或pH4.0的饱和KCl溶液中）Mixer M-925 检查混合仪及接头是否松动,维护每年,Valve IN
9、V-907,IV-908 and PV-908 检查阀是否渗漏，如果渗漏则需更换阀头,维护每两年 Mixer M-925 更换混合池,系统清洗（Cleaning the system）,每天工作结束后(At the end of the day)如果系统仍将使用之前一天的相同缓冲液，则可以用10的使用流速，用缓冲液冲洗泵如果将在第二天更换缓冲液，则需用水用PumpWash功能将泵冲洗干净几天停用仪器（Leaving for a few days）先用水PumpWash冲洗之后，再用20%的乙醇将系统冲洗干净，包括所有的进口管路和出口管路都用20的乙醇保存好,每月清洗（Monthly cleaning）必须每月按时清洗系统或在遇到问题时清洗系统（如色普峰出现重影）：用1M NaOH，执行SystemWash指令.之后立即用水将NaOH冲洗干净.,系统移动（Moving the system）,移动系统时小心谨慎，拆下外围的部件和管道，并防止剧烈震动，,小心！（WARNING!）,在更换部件时必须关掉所有的电源.如果有水或缓冲液渗入到仪器内部带电部位，须立即关掉电源，并求助于维修工程师,P900柱塞泵初次使用或停用一段时间后再次使用时，首先以较低的流速运行，逐渐增加流速。切记不要开机后即高速运行,
