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1、第二章 蛋白质组与蛋白质组学,河南科技学院 牛立元,主要内容 一、蛋白质组的基本概念和历史 二、蛋白质组的特征 三、蛋白质组与基因组的关系 四、蛋白质组的研究技术和研究策略,第二章 蛋白质组与蛋白质组学,1、蛋白质组和蛋白质组学 蛋白质组是澳大利亚学者Williams 和 Wilkins于1994年首先提出。“Proteome”源于蛋白质(Protein)和基因组(genome)两个词的结合，用于表示一种细胞、组织或生物个体所能表达出来的所有蛋白质。蛋白质组是一个基因组所能表达出来的所有蛋白质构成的整体，不是局限于一个或几个蛋白质。同一基因组在不同细胞、不同组织中的表达情况各不相同。,一、蛋白
2、质组的基本概念和历史,蛋白质组学(proteomics)是研究蛋白质组成及其功能网络的科学。一般认为蛋白质组学是研究蛋白质组或应用大规模蛋白质分离和识别技术研究蛋白质组的一门学科，是对基因组所表达的整套蛋白质的分析。Proteomics 通过对细胞内蛋白质组成种类、丰度、功能变化及与细胞或生物个体机能变化相互联系的分析，揭示细胞或生物生命活动规律。主要研究内容：表达蛋白质组学 特定的细胞、组织或器官合成的蛋白质种类、丰度及功能，关键技术 2-D电泳等。,一、蛋白质组的基本概念和历史,一、蛋白质组的基本概念和历史,结构蛋白质组学 蛋白质的序列和高级结构，X-射线单晶衍射分析（晶体结构分析）、多维
3、核磁共振波谱分析、电镜二维晶体三维重构术（电子晶体学）。细胞图谱蛋白质组学 蛋白质的胞内分布及移位，确定蛋白质在亚细胞结构中的位置，通过纯化细胞器或用质谱仪鉴定蛋白复合物组成等。功能蛋白质组学 蛋白质的功能模式，蛋白质与蛋白质及其与其他分子的相互作用。,2、蛋白质组研究简况 1975年，首先由OFarrell等创立Two-dimensional electrophoresis。1997 年 Wilkins,M.and Williams 提出了蛋白质组的概念。1997年召开了第一次国际“蛋白质组学”会议。1999年1月在英国伦敦举行了应用蛋白质组会议。我国也于1998年启动了蛋白质组学研究，在中
4、科院上海生物化学研究所举办了两次全国性的蛋白质组学研讨会。,一、蛋白质组的基本概念和历史,2003年成立了中国人类蛋白质组组织（CHHUPO）。2003年9月、2004年8月以及2005年8月召开了中国蛋白质组学首届、第二届及第三届学术大会。2004年10月在中国北京召开了第三届国际蛋白质组学会议。科技部已将疾病蛋白质组研究列入我国“973”计划项目和“863”计划项目；国家自然科学基金委员会也将“蛋白质组研究”列为重点项目。我国在鼻咽癌、白血病、肝癌和肺癌蛋白质组研究方面取得了较大的进展。,一、蛋白质组的基本概念和历史,3.Why is proteomics necessary Displa
5、ying and studying the products of genes directly is an attractive way of studying disease and complex problem in biology The study of gene expression can also be attempted at the level of mRNA(microarray.)However(1)You can have a protein in the cell when its mRNA is no longer present;(2)You can have
6、 lots of mRNA without translation of the message to protein;,一、蛋白质组的基本概念和历史,(3)No good correlation between mRNA abudence and protein amout in a cell at a given time;(4)Protein post-translational modification;(5)Protein subcellular location.Proteomics directly contributes to Annotation of genome.,一、蛋
7、白质组的基本概念和历史,蛋白质的“四维”研究 特定的时间：合成与降解 特定的空间：区域性与运动性 Dynamic Proteomics(动态蛋白质组学)动态表达、动态组成、动态定位、动态关系 动态表达：通过对疾病发生,发展,预后过程中的蛋白质差异谱构建,跟踪关键蛋白质在疾病不同时期动态表达。蛋白质表达量的差异是功能变化的基础之一。,二、蛋白质组的特征,动态组成：蛋白质翻译后修饰,如磷酸化，糖基化,乙酰化等的大规模分析和监测。蛋白质翻译后修饰增加蛋白质的复杂性，信号传递的方式。动态定位：亚细胞蛋白质组分析及定位，与功能相关的蛋白质空间动态变化分析。定位变化导致相互作用的改变，蛋白质群功能改变。动
8、态关系：蛋白质功能复合物，蛋白质-蛋白质作用网络，蛋白质与小分子配体相互作用分析。不同的蛋白质群及其结构发挥不同的功能。,二、蛋白质组的特征,蛋白质组的确定？1，蛋白质组的完整性：基因组内基因（或ORF）数量？基因表达？2，蛋白质组的测定：修饰蛋白质的判据？蛋白质的动态变化（降解或转运）？,二、蛋白质组的特征,三、蛋白质组与基因组的关系,（一）蛋白质组研究技术的复杂性 具有比基因组学研究更高的复杂性：20种化学和物理性质不同的氨基酸。蛋白质量的动态差别（106）。蛋白质的不稳定性。蛋白质修饰的多样性和复杂性。,四、蛋白质组的研究技术和研究策略,（一）蛋白质组研究技术的复杂性,1、基于二维电泳-
9、质谱技术的蛋白质组研究 2、基于液相色谱（电泳）-质谱技术的蛋白质组研究 液相电泳-质谱技术 液相色谱-质联用技术 同位素亲和标签技术(isotope-coded affinity tages,ICAT)3、蛋白质芯片,（二）蛋白质组学的主要研究方法,Two-dimensional Electrophoresis(2-DE),1st dimension:isoelectric focusing(IEF)proteins are separated in a pH gradient until reach a stationary position where their net charge
10、is zero.The pH at which a protein has zero net charge is called isoelectric point(pI).2nd dimension:SDS-PAGE Proteins are separated according their molecular weight(Mr),（二）蛋白质组学的主要研究方法,1980sThe introduction of immobilised pH gradient(IPG)eliminlated the problem of gradient instability and poor sampl
11、e loading capacity,Immobilised pH gradient(IPG)pH gradient(ampholyte)is co-polymerised with the acrylamide gel matrix to form completely stable gradients.The commercial precast IPG stripes is available in various pH ranges(3-10,4-7.).,（二）蛋白质组学的主要研究方法,2-DE is the only method currently available which
12、 iscapable of simultaneously separating thousands of proteins,（二）蛋白质组学的主要研究方法,Cell culture,Protein extraction,2-DE,Silver staining,Image analysis,Scanning,（二）蛋白质组学的主要研究方法,The 1st D:Isoelectric Focusing,（二）蛋白质组学的主要研究方法,电荷,分子量,2-D 理论,（二）蛋白质组学的主要研究方法,（二）蛋白质组学的主要研究方法,低通量（1-2块胶）用于一般分析实验,高通量（1-12块胶）用于大规模蛋
13、白质组实验,Mini PROTEAN3 Dodeca(7cm),CriterionTM Dodeca Cell(11cm),PROTEAN Plus Dodeca(17,18,24cm),第二向SDS PAGE,（二）蛋白质组学的主要研究方法,2-D 胶分析分析软件全自动点检测和定量分析，可同时进行100块以上胶的分析，数据库对胶的数目没有限制，可进行统计分析，可对每组胶进行差异表达分析，蛋白进行注释和索引。,（二）蛋白质组学的主要研究方法,pI,M.Wt.,（二）蛋白质组学的主要研究方法,Differential Analysis,Proteins fromcultured human ce
14、llsA=Derivative of B,A,B,（二）蛋白质组学的主要研究方法,E.Coli grown at 30 C,E.Coli grown at 42 C,Differential Expression,（二）蛋白质组学的主要研究方法,荧光差异染色 利用两种不同的荧光染料如Cy3（绿光）和Cy5（红光）分别对从对照和处理材料提取的蛋白质进行标记、混合、混合样品进行蛋白质双向电泳分离，分别以两种不同的激光去激发扫描生成两种不同的彩色图像，然后再将两者叠加，根据电泳斑点所形成的颜色判断蛋白质的代谢变化。黄色：没有差异 红色：上调 绿色：下调,（二）蛋白质组学的主要研究方法,（二）蛋白质组
15、学的主要研究方法,2-DE技术的缺点：极酸、极碱性蛋白质，疏水性蛋白质，分子量极大极小蛋白质以及低丰度蛋白质用此种技术难于有效分离。胶内酶解过程费时、费力，难于与质谱联用实现自动化。液相色谱法(liquid chromatography，LC);毛细管电泳(capillary electrophoresis，CE);液质联用技术（LC-MS/MS）.,（二）蛋白质组学的主要研究方法,同位素标记亲和标签方法 Aebersold 和其合作者建立的一种同位素标记亲和标签试剂(isotopically coded affinity tag，ICAT)差异蛋白鉴定方法。ICAT试剂的结构包含一个生物素头
16、部、一个连接部分和一个碘激活的羰基基团，其中羰基基团能够特异性地与肽链中的半胱氨酸侧链反应，借助于生物素亲和标记将其抽提出来。重同位素的形态与轻同位素的形态的差别相当于在连接区部分的8个氢原子被8个氘原子取代。,（二）蛋白质组学的主要研究方法,（二）蛋白质组学的主要研究方法,同位素标记亲和标签方法,（1）两个蛋白质样品(细胞状态I和细胞状态)分别单独用d0ICAT和d8ICAT试剂标记；（2）混合、胰蛋白酶水解；（3）肽混合物用生物素亲和色谱柱分析，含半胱氨酸残基肽被结合在柱上；（4）洗脱、串联质谱检测定量。一对不同标记的肽几乎在相同的时间洗脱，可以通过两个距离为8 Da的质谱信号识别出来。参
17、考文献：同位素亲和标签(ICAT)系列技术及其在蛋白质组研究中的应用,（二）蛋白质组学的主要研究方法,蛋白芯片(protein chip)技术,（二）蛋白质组学的主要研究方法,（1）点样：未经处理的样品(如血清，尿液等)直接点在芯片上，根据芯片表面不同的化学或生物特性结合相应的蛋白质；（2）冲洗：洗去芯片上结合的非蛋白组份；（3）加上能量吸收分子溶液：在芯片表面形成含有分析物和大量能量吸收分子“晶体”；（4）激光解吸电离法(SELDI)：将保留在芯片上的蛋白质洗脱下来；（5）质谱分析：电离的蛋白质可以通过飞行时间质谱仪精确地测定它们的质量。,（二）蛋白质组学的主要研究方法,Mass Spect
18、rometry,（三）质谱在蛋白质鉴定中的应用,TOF-MS instrument with a single acceleration stage,FEq F=ma a=Eq/m,（三）质谱在蛋白质鉴定中的应用,（三）质谱在蛋白质鉴定中的应用,肽质量纹鉴定法 Peptide Mass Fingerprinting(PMF）是目前蛋白质组研究中较为常用的鉴定方法这一技术于1993年被多个研究小组分别独立提出。肽质量指纹鉴定的依据：第一种蛋白质都有特定的氨基酸序列，被特定的蛋白质酶水解可以得到一套特定肽链片断（肽片段质量图谱）。由于每种蛋白质的氨基酸序列都不同，蛋白质被酶水解后，产生的肽片段序列
19、也各不相同，肽片段质量图谱可用于蛋白质的鉴定。,（三）质谱在蛋白质鉴定中的应用,由于在ESI条件下待分析物可能带上一个或多个电荷，而MALDI-TOF(Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometry,基质辅助激光解析电离飞行时间质谱)分析中的离子一般只带一个电荷，比较容易计算。另外，由于MALDI-TOF质谱仪产生的质谱图精度较高，而由ESI质谱仪产生的质谱图精度相对较低。目前一级质谱鉴定蛋白质的算法（肽质量纹）主要用在MALDI-TOF产生的质谱图上。多肽质量纹一般都是在MALDI-TO
20、F仪器的结果上进行。,（三）质谱在蛋白质鉴定中的应用,Bovine Carbonic anhydraseand human Hsp70s protein（一级质谱）,（三）质谱在蛋白质鉴定中的应用,（三）质谱在蛋白质鉴定中的应用,PMF中的问题（1）质量相近的多肽怎么处理？限制用来搜索的数据库，如果做的试验用的是小白鼠的组织，那么你可以只在鼠类的数据库中搜索；要求必须有多个多肽和数据库相匹配，才做出最后的蛋白质鉴定。（2）一张质谱图中可能有多个蛋白存在？通常，MALDI-TOF是与双向电泳连接使用。双向电泳的一个电泳点上可能有2-3个蛋白。,（三）质谱在蛋白质鉴定中的应用,肽氨基酸序列法 在一
21、级质谱图中，选择其中的一个峰，对其进行CID（Collision-induced Dissociation），使其在特定的部位断裂就得到一张二级质谱图。这里的假设是一级质谱中的一个峰就对应了一个多肽，实际情况可能并不是这样。对于一张一级质谱图，可以选择多个峰进行二级质谱的操作。这样就可以适应一张质谱图里有多个蛋白的情况。,（三）质谱在蛋白质鉴定中的应用,（三）质谱在蛋白质鉴定中的应用,二级质谱图,（三）质谱在蛋白质鉴定中的应用,多肽在质谱分析中的可能断裂方式,Peptide Sequences and Mass Measurements,（三）质谱在蛋白质鉴定中的应用,Fregmentatio
22、n of Peptide Ions,（三）质谱在蛋白质鉴定中的应用,Typical Peptide MS/MS Spectrum,（三）质谱在蛋白质鉴定中的应用,数据库搜索的流程 常用的二级质谱的数据库搜索算法包括：Sequest；Mascot；Sonar,GutenTag,OLAV,ProbID。数据库搜索算法一般包括两个步骤：第一个步骤是筛选数据库里的多肽，找出所有可能与质谱图匹配的多肽。第二个步骤就是拿这些选出来的多肽去和质谱图进行比对，并输出最高分值的多肽作为一个PSM（Peptide-Spectrum Match）。,（三）质谱在蛋白质鉴定中的应用,MS for Characterization of Proteins and peptide,MS for Characterization of Proteins and peptide,（三）质谱在蛋白质鉴定中的应用,参考文献：肽质量指纹谱鉴定蛋白质时生物信息学分析条件的优化,（三）质谱在蛋白质鉴定中的应用,
