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1、DNA甲基化对核小体结构的影响,报告人：沈伟,DNA Methylation Increases Nucleosome Compaction and RigidityJohn S.Choy,Sijie Wei,Ju Yeon Lee,Song Tan,Steven Chu,and Tae-Hee Lee*Department of Chemistry,The Pennsylvania State University,University Park,Pennsylvania 16802,United States J.AM.CHEM.SOC.VOL.132,NO.6,2010 Effects
2、of DNA Methylation on the Structure of NucleosomesJu Yeon Lee and Tae-Hee Lee*Department of Physics,Bio-X Program,Stanford UniVersity,Stanford,California 94305,and Department ofChemistry and Department of Biochemistry&Molecular Biology,The PennsylVania State UniVersity,UniVersity Park,PennsylVania 1
3、6802 J.Am.Chem.Soc.2012,134,173175,JACS,核小体：,H2A H2B H3 H4 200碱基对的DNA,DNA甲基化有什么用？,同卵双胞胎也有不同性状不全是由碱基的顺序决定基因转录以染色质的解螺旋为前提表观遗传CPG岛-启动子,CpG甲基化-核小体的结构了解基因表达新药开发治疗CpG甲基化有关的疾病ATTENTION:癌症共同特征之一：启动子区甲基化-抑癌基因失活,启动子附近的甲基化CpG岛可防止转录酶结合转录抑制因子结合甲基化的CpG岛,即通过蛋白的作用致使染色质交联从而阻止转录另外由于DNA和组蛋白结合在一起，还可能是甲基化改变了核小体的结构,甲基化如何
4、影响性状？,anyway，并不否认前两种假设存在,我们关心的：可否证实第三种假设属实呢？-怎么检测？,单分子检测更加直观，全面，精确(fuorescence resonance energy transfer,FRET),单分子荧光共振能量转移技术,SM FRET measurements,Single molecule fluroescence intensities were taken with a sensitive CCD camera(iXon+897,Andor Technology,Belfast UK)in a prism coupled total internal ref
5、lection(TIR)geometry based on a commercial microscope(TE2000,Nikon,Tokyo Japan)with modifications.,The excitation is perpendicularly polarized along the TIR incidence.,Imaging was done in a buffer with 10mM HEPES pH 7.6,50mM NaCl,5mM MgCl 2,1mM DTT,6%glycerol and 0.4%glucose.Glucose oxydase(0.08 U/u
6、L,Sigma Aldrich)and Catalase(2.3 U/uL,Sigma Aldrich)mixture was used to elongate the dye photobleaching lifetime.,荧光共振能量转移效率理论公式,主要检测什么？,荧光共振能量转移效率实际测量公式,-可以由测得的荧光能量转移效率和求得的常量R0来计算出：能量供体与受体间的距离R即DNA两端的实际距离,测得不同的FRET效率 代表不同的DNA实际两端距离 表示DNA不同的缠绕方式 不同的核小体结构,单分子的构建,天然凝胶电泳cy3，cy5 channel两种核小体带,FRET检测结果,蓝
7、色表示FRET效率红色绿色表示荧光强度，即所占数量,FRET 0.29,FRET 0.4,DNA甲基化如何影响核小体结构？,DNA与组蛋白作用的强弱强则DNA短，结构封闭弱则DNA长，结构松散除了FRET效率支持这个解释，荧光的各向异性也可以解释,偏振度,FRET效率高对应的荧光偏振度也高，说明核小体结构更紧密,进一步的，该课题组做了更深入的研究发现CpG基甲基化DNA紧密包裹组蛋白核心拓扑结构的变化。,两种不同的核小体构建,两种核小体甲基化前后的FRET效率对比,601+39核小体甲基化前后偶极子取向角变化,conclusion,CpG甲基化对核小体的结构的以下影响：DNA更紧密的缠绕组蛋白，刚性增加拓扑结构的变化，DNA缠绕增多两者都有利于形成抑制性（不活跃的）的染色质结构，抑制基因表达,首创性单分子检测,该工作的亮点,QUESTION,为何没有直接观测核小体结构变化？能否定量？,谢谢！,
