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1、DNA电泳及应用技术,找答案,基因操作中常用电泳有哪些？差别在哪里？影响凝胶电泳的 因素有哪些？聚丙烯酰胺凝胶是怎么样构成的？,电泳：是指带电粒子在电场中向与其自身 带相反电荷的电极移动的现象。,概 述,凝胶电泳：由琼脂、琼脂糖、淀粉胶及聚丙烯酰胺 等物质作支持体的电泳。特点：1.可以制成非常均匀的凝胶，带电质点在凝胶的孔中泳动。2.电泳操作方法简便，电泳速度快3.分辨率高，重复性好，电泳图谱清晰。4.适用于生化，免疫等定性定量测定,琼脂糖凝胶,天然琼脂（agar）:又名琼胶、菜燕、冻粉 从石花菜及其它红藻类植物提取出来的一种线状高聚物。,琼脂糖（agarose）琼脂胶（agaropectin
2、）,琼脂糖 半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。,琼脂糖凝胶的特点,（一）优点1.分离范围广，约200bp50kb的核酸均可。3.凝胶结构均匀，孔径较大，可用来分离酶的复合物、核酸、病毒 等大分子物质。4.透明度较好，可直接或干燥成薄膜后进行染色。5.不吸收紫外光，可直接利用紫外光吸收法作定量测定6.有热可逆性,（二）缺点1.机械强度差，易破碎，浓度不能太低。2.易被细菌污染，不易保存，临用前配制。3.琼脂糖支持层上的区带易于扩散，电泳后必须立即固定染色。4.与聚丙烯酰胺电泳相比，分辨率低。,影响核酸凝胶电泳的因素：,1样品核酸的性
3、质 2电场强度和电场方向3电泳环境：缓冲液的组成和离子强度直接 影响迁移率4凝胶孔径的大小。,什么是迁移率,带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度影响因素有：,1、DNA的分子大小,线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中蠕行，因而迁移得越慢。,2、琼脂糖浓度,DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。,配制多大浓度的琼脂糖凝胶，要根据被检的 DNA分子大小来确定。,琼脂糖凝胶浓度与线性DNA分辨范围,3、DNA分子的构象,相同分子量的线状、开环和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中移动速度超螺旋DNA最快,而开环双链DNA移动
4、最慢。,4、电源电压,在低电压时,线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。随着电场强度的增加，片段越大,因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。,5、嵌入染料的存在,荧光染料溴化乙啶（EB）用于检测琼脂糖凝胶中的DNA,染料会嵌入到堆积的碱基对之间，使线状DNA迁移率降低15。,常用染料,EB:溴化乙锭，能插入DNA分子碱基对之间，导致EB与DNA结合。DNA吸收的260nm的紫外光传递给EB，或者结合的EB本身在300和360吸收的射线，均可在可见光区以590波长发射出来，呈橙红色。优点：染色操作简便，快速，室温下15-20min；不会使核酸断裂；灵敏度高，10
5、ng或更少的DNA即可检出；可以加到样品中。EB是诱变剂，使用时一定要戴手套。EB废液要经过处理才能丢弃。,SYBR:新型低毒，高灵敏度染料，加入样 品中，价格较昂贵。Gene finder:新型低毒，高灵敏度染料，加入样胶中，价格较低。,6、离子强度影响,电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。没有离子存在时(如误用蒸馏水配制凝胶),电导率最小,DNA几乎不移动在高离子强度的缓冲液中(如误加10电泳缓冲液),严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。,常用的电泳缓冲液,一般配制成浓缩母液,储于4 保存备用.,实验步骤 1g 琼脂糖加入100ml 1TAE电泳缓冲液中，摇匀。在微波炉中加热
6、至琼脂糖完全溶解。（冷却到60，加入100l的0.5mg/ml EB，并摇匀。）,用胶带将制胶板两端封好，插入适当梳子，将溶解的琼脂糖（约50）倒入，室温冷却凝固。,充分凝固后撕掉两端的胶布，将凝胶置入电泳槽中，加1TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1-2mm，小心垂直向上拔出梳子。,用移液器吸取总DNA或质粒样品4l于封口膜上，再加入2l 的6X载样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔 打开电源开关，调节电压至3-5V/cm，可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，电泳约30min-60min。,。,将凝胶放入EB染液中染色5-10min,用清水稍微漂洗。将染色后的凝胶置于紫外透射检测仪上，盖上防护观察罩，
7、打开紫外灯，可见到发出荧光的DNA条带。,植物总（核）DNA样品应呈现一条迁移率很小的整齐条带。,琼脂糖凝胶电泳的实验技巧和方法,1.）加样时枪头不要碰坏凝胶壁，否则DNA的带型将不会整齐，加样前要用枪头吸打凝胶孔中的溶液，以赶走样品空中的气泡。2.）每孔最大DNA上样量决定于DNA样品片段的大小、数目及样品孔形状与容量。,3.）应注意每孔最大上样容量及样品孔体积，以免加样时样品流入附近样品孔造成交叉污染，影响结果分析。,4.）在实验加样中不一定每一个样品都换一个枪头，可在阳极槽中反复吸打电泳缓冲液以清洗。（对于需要回收DNA片段的电泳除外。）,注意事项,1.）凝胶中加入EB进行电泳，便于紫外
8、线下观察电泳状态，但EB会导致线形DNA迁移率下降。2.）判断正负极的另一方法是负极气泡（H2）比正极气泡（O2）多一倍。,3.）电泳过程中，EB与DNA泳动的方向相反，长时间会造成靠正极方向的凝胶中EB含量低，会对含量较少的小分子DNA片段检测困难。处理方法是：将凝胶在0.5ug/ml的EB溶液中染色3045分钟。,操作,使用3 mg的DNA Marker DL2,000（500 ng/条带）进行1%的琼脂糖凝胶电泳后，各DNA条带自上至下分别为2kb，1Kb，750bp，500bp，250bp，100bp。,二、聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶是三维网状结构的凝胶，其为支持物的电泳称为聚
9、丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE)。,在成分：丙烯酰胺(简称Acr)和N,N-甲叉双丙烯酰胺(简称Bis)加速剂：N，N，N，N四甲基乙二胺(简称 TEMED)催化剂：过硫酸铵(NH4)2S2O8，简称AP)或 核黄素(即vita min B2)的作用下聚合交联形成,聚丙烯酰胺凝胶有下列特性：(1)在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好；(2)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂中不溶；(3)对pH和温度变化较稳定；,(4)几乎无吸附和电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好；(5)样品不易
10、扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g,(6)凝胶孔径可调节：通过改变Acr及Bis的浓度调节凝胶的孔径；(7)分辨率高：尤其在不连续凝胶电泳中较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。,聚丙烯酰胺凝胶电泳分为连续系统与不连续系统两大类。目前常用的多为圆盘电泳(如图1)和板状电泳(如图2)，两者电泳原理完全相同。,图1 聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图(A为正面,B为剖面)(1)样品胶pH6.7(2)浓缩胶pH6.7(3)分离胶pH8.9(4)电极缓冲液pH8.3,图2 夹心垂直板电泳槽示意图 图3 凝胶模示意图,不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。浓缩胶是大孔胶，凝胶缓冲液为pH
11、6.7的Tris-HC1。分离胶是小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HC1。电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。,图4 电泳过程示意图A为电泳前3层凝胶排列顺序，3层胶中均有快离子，慢离子B显示电泳开始后，蛋白质样品夹在快、慢离子之间被浓缩成极窄的区带。C显示蛋白质样品分离成数个区带。,（二）影响凝胶聚合的因素1、试剂质量2、凝胶浓度3、温度和氧气的影响,凝胶电泳的操作要点,1 凝胶制备2 电极缓冲液3 样品处理及加样4 电泳5 染色与固定6 脱色7
12、 分析,实验步骤,1.胶模固定：将两块洗净的玻璃板，按要求 对齐，夹好。将胶模装入电泳 槽固定好，并将胶模下端封 好，防漏。(电泳槽按要求清洗干净)。,2.制备分离胶：按分离胶配制方法配好分离 胶，缓慢注入胶模中（占玻璃 板的2/3），室温下聚合40min。,制备浓缩胶：配制好3%浓缩胶。将胶模 中上层水倾倒出去，用滤纸 吸干余水。倒入浓缩胶插好 样品梳，注意避免汽泡出现。,电泳：将胶模装好，去胶条后，装入电泳 槽中，检查是否漏液后，倒入电泳缓 冲液，胶模内侧的液面没过矮板但不 可超过高板（矮板在内）。,上样：将样品梳拔出，用电极缓冲液冲洗样 品孔。样品与样品缓冲液按一定比例 混合好。用微量注
13、射器加入加样孔，加样量为510l。,电泳:连接直流稳压电源，矮板连负极，打 开电源开关。调节电流，进入分离胶之前为 10mA，进入分离胶之后为2OmA。,染色:关闭电源，取下凝胶模。用剪刀、靠 水流压力和润滑作用，将玻璃板与胶 分开。在脱色摇床上用考马斯亮兰染色1h。,8 脱色：将胶取出，蒸馏水冲洗数次后，放 入脱色液中，数小时换液一次，直 至背景清晰为止。,烟曲霉菌中抗真菌活性肽类物质的分离与纯化,三、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,（一）基本原理在聚丙烯酰胺凝胶中加入SDS（阴离子去污剂十二烷基硫酸钠），不影响凝胶的形成，不影响蛋白质的电泳迁移率，因蛋白质的电泳迁移率主要取决于其自身分子量的大小。SDS能打开蛋白质分子间的氢键和疏水键，使蛋白质变性成为松散的线状。同时大多数蛋白质的每个氨基酸能与固定量的SDS相结合，形成SDS蛋白质复合物。,（二）SDS-聚丙烯酰胺凝胶胶体的制备,（三）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的优缺点 及应用 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳具有设备简单，样品用量甚微，操作方便等优点，现已成为测定大多数蛋白质分子量的常用方法,不连续凝胶电泳示意图,
