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1、噬菌体T2DNA长约50m,E-coli DNA 长约1mm,人生殖细胞DNA长约1m,（三）DNA的三级结构,双链环状DNA（double stranded cyclic DNA,DSCDNA）,双链环状DNA在自然界是广泛存在的，如一些病毒DNA、一些噬菌体DNA、细菌质粒DNA、线粒体和叶绿体DNA等。,1共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA,cccDNA）的超螺旋结构（superhelical structure）,形成超螺旋的基础:,DNA双螺旋的扭曲形成超螺旋（superhelix）,负超螺旋,正超螺旋,超螺旋DNA的性质,结构紧密，粘度
2、较低，浮力密度大，沉降速度快。,变性,2开环DNA（open circular DNA,ocDNA）,也称松环DNA（relaxed circular DNA,rcDNA）,+,3连环DNA（Catenanes DNA）,单体,二聚体,1重复序列（repeated sequence）,（1）高度重复序列（highly repeated sequence）,卫星DNA（satellite DNA）,基因组（genome）,（四）真核细胞染色体DNA结构,主体DNA（bulk DNA）,卫星DNA（satellite DNA）,（2）中度重复序列（moderately repeated seque
3、nce）,（3）单一序列（unique sequence）,2回文结构（palindromic structure）,(1)回文结构,回文结构也称反向重复（inverted repeats）,(2)发夹形和十字形,（一）RNA的类别,1核糖体RNA（ribosomal RNA,rRNA）,2转移RNA（transfer RNA,tRNA）,3信使RNA（messenger RNA,mRNA）,五、RNA的结构,4其它类别的RNA,（1）病毒RNA（Viral RNA,rRNA）,（2）核内RNA（nuclear RNA,nRNA）,不均一核RNA（heterogeneous nuclear R
4、NA,HnRNA）,小分子核RNA（small nuclear RNA,sn RNA）,小分子核仁RNA（small nucleolar RNA,sno RNA）,染色体RNA（chromosomal RNA,ch RNA）,（3）线粒体RNA（mitochondrial RNA,mit RNA）,（4）叶绿体RNA（chloroplast RNA,chlRNA或ctRNA）,（二）RNA的一级结构,1RNA分子中核苷酸之间的连接方式,3,5-磷酸二酯键,2RNA分子中核苷酸的排列顺序,酵母tRNAAla,小片段重叠法,直接阅读法（直读法）,1965年,3几类RNA的一级结构,（1）tRNA的
5、一级结构,tRNA一级结构的共同点:,Mr较小（Mr25000），沉降常数4S。,各种tRNA的链长很接近，一般在7393个核苷酸之间。,tRNA分子中约20多个位置上的核苷酸是保守的（不变和半不变的）,各种tRNA的3一端为CCA；5一端大多数为pG，少数为pC。,tRNA分子中含有较多的修饰成分。,（2）rRNA的一级结构,原核生物核糖体,70S,50S,30S,5S rRNA，23S rRNA,34种蛋白质,16S rRNA,21种蛋白质,真核生物核糖体,80S,60S,40S,5SrRNA，5.8SrRNA，28SrRNA,49种蛋白质,18SrRNA,33种蛋白质,（3）mRNA的一
6、级结构,真核生物mRNA的一级结构可用下式表示:,5-cap：m7G(5)pppNmp,5-cap,cap0:m7G(5)pppNp,cap1:m7G(5)pppNmpNp,cap2:m7G(5)pppNmpNmpNp,5-cap的功能,(1)防止mRNA被核酸酶降解。,(2)为mRNA翻译活性所必需。,(3)与蛋白质合成的正确起始有关。,3-polyA:polyA的残基数20200个，或更多。,polyA的功能,(1)保护mRNA，免受核酸外切酶的作用。,(2)与翻译有关，没有polyA翻译活性降低。,(3)与mRNA从细胞核转移到细胞质有关。,（三）RNA的二级结构,大多数天然RNA是一条
7、单链，通过自身回折形成部分螺旋区，部分非螺旋区。,少数病毒RNA如水稻矮缩病毒、呼肠孤病毒、伤瘤病毒等RNA是双链螺旋，类似于DNA的双螺旋结构。,RNA中双螺旋结构稳定的因素主要是碱基堆积力，其次是氢键。,1tRNA的二级结构,（1）aa接受臂（amino acid arm）,（2）二氢尿嘧啶环（dihydrouridine loop,DHU loop）,（3）反密码环（anticodon loop）,（4）额外环（extra loop）,（5）TC环（TC loop）,X光晶体衍射解出的 tRNA 立体结构,1980年牛心线粒体tRNAser只有63个核苷酸，沉降常数3S，缺少D环和D臂，
8、呈二叶草型。,近年来发现2种线虫线粒体tRNA也不是标准的三叶草结构。,2rRNA的二级结构,3mRNA的二级结构,The secondary structure of HEC-SODs mRNA.the free energy of result is 587.9J.,（四）RNA的三级结构,tRNA的三级结构,六、核酸酶类,包括核酸水解酶、合成酶、连接酶等。,（一）核酸水解酶的分类,1底物：核糖核酸酶（ribonuclease,RNase）,脱氧核糖核酸酶（deoxyribonuclease,DNase）,2作用方式：核酸内切酶（endonuclease）,3按磷酸二酯键断裂的方式,4其它
9、：如双链酶、单链酶等,核酸外切酶（exonuclease）,（二）核糖核酸酶类,1牛胰核糖核酸酶（pancreatic ribonuclease,简称RNase A或RNase I）,2核糖核酸酶T1（ribonuclease T1，简称RNase T1）,3核糖核酸酶T2（ribonuclease T2，简称RNase T2）,主要作用点为Ap残基，水解速度AUGC,（三）脱氧核糖核酸酶,1牛胰脱氧核糖核酸酶（pancreatic deoxyribonuclease简称DNase I）,2牛脾脱氧核糖核酸酶（spleen deoxyribonuclease,简称DNase II）,3限制性内
10、切酶（restriction endonuclease）简称限制酶,限制性内切酶主要降解外源的未经特殊修饰的DNA，对自身起了保护作用。,发现概况:,（1）限制性内切酶的特征,具有严格的碱基专一性，有专一的识别顺序、切点,粘性未端，平整末端,（2）限制性内切酶的命名,EcoRI,（3）限制性内切酶举例,（四）非专一性核酸酶类（nonspecific nuclease）,介绍二种外切酶,1蛇毒磷酸二酯酶（venom phosphodiesterase）,5-核苷酸,蛇毒磷酸二酯酶对末端磷酸基有严格的要求,橘青霉磷酸二酯酶专一性：与蛇毒磷酸二酯酶相同,2牛脾磷酸二酯酶,对末端磷酸基的要求与蛇毒磷酸
11、二酯酶相反,（五）磷酸单酯酶,将单核苷酸或寡核苷酸末端的磷酸单酯键切开，得到磷酸和其它产物,1特异性磷酸单酯酶,2非特异性磷酸单酯酶,磷酸基无论在3或5位，都能水解，如E.coli磷酸单酯酶,（一）一般性质：分子大小、性状、溶解度。,分子大小：DNA Mr 1061010或更大,性状：DNA为白色纤维状固体，而RNA为白色粉末。,溶解度：DNA和RNA均不溶于一般的有机溶剂，微溶于水，但它们的钠盐在水中溶解度较大。,RNA Mr 104106或更大,七、核酸的性质和最常用的研究方法,（二）粘度,（三）酸碱性质,（四）紫外吸收,由于核酸中碱基的共轭双键，所以对紫外有强烈吸收，最大吸收峰在260n
12、m附近，利用这一特性可进行核酸的定量测定。,1紫外分光光度法,首先根据A260/A280的比值判断核酸样品的纯度,纯DNA：A260/A280=1.8 纯RNA：A260/A280=2.0,（若样品中含有杂蛋白或苯酚，则A260/A280比值明显降低）,纯的核酸样品可根据260nm的光吸收值算出其含量,若260nm光吸收值为1相当于50g/ml双螺旋DNA,或相当于40g/ml单链DNA或RNA,或相当于20g/ml寡核苷酸。,2摩尔磷消光系数（molar absorptivity）法,A：样品的光吸收值,C：每升溶液中磷的摩尔数,L：光径,在pH7.0时；DNA的 为6600,RNA的 为7
13、7007800。,：摩尔磷消光系数，也称摩尔磷吸光系数,知道了磷的含量就可知核酸的含量,3增色效应与减色效应,增色效应（hyperchromic effect）,减色效应（hypochromic effect）,（五）沉降特性,1核酸浮力密度的测定,浮力密度：经密度梯度沉降平衡法测出的密度,氯化绝（CsCl）密度梯度沉降平衡,用12个已知浮力密度的标准DNA样品作参考,式中：未知DNA的密度,0：标准DNA的密度,：角速度（弧度/秒）,r：未知DNA与转轴之间的距离,r0：已知DNA与转轴之间的距离,2DNA中G-C含量的测定,G-C对的含量与浮力密度之间呈正比关系,Rolfe-Meselso
14、n导出了如下公式：,=0.100（G-C%）+1.658(g/cm3),知道了浮力密度就可计算出G-C对的含量,3核酸的构象和分离,：RNA环状DNA线状DNA蛋白质,DNA 沉降,（六）核酸的变性、复性和杂交,1变性（denaturation）,核酸变性的概念,引起核酸变性的因素,（1）热变性,结构：螺旋线团,理化性质：紫外吸收 粘度比旋光度,生物活性：生物活性或丧失,（2）熔点（Tm）,Tm:熔点，熔解温度，变性温度，解链温度,（3）影响Tm值的因素,DNA的均一性,DNA中G-C对的含量,经验式:(G-C)%=(Tm-69.3)2.44,盐离子强度,2复性（renaturation）,（
15、1）复性,理化性质:比旋光度 粘度,复性 也称退火,（annealing）,生物活性得到部分恢复,（2）影响复性的因素,样品的性质,DNA的浓度,DNA片段的大小,温度,离子强度,（3）复性动力学,DNA的复性过程是一种双分子反应,S：single strand DNA,D：double strand DNA,经重排，积分等,式中 C0：t=0时，起始DNA的浓度（mol/L）,C：t时间时，单链DNA的浓度（mol/L）,k：复性反应常数（L/molsec）,t：复性时间（sec）,Cot:,时的Cot值，即指复性完成一半时的Cot值。,3杂交（hybridization）,核酸的杂交：是指
16、不同来源的单链核酸之间可通过 碱基互补形成双螺旋结构。,单链DNA与单链DNA杂交（DNA-DNA）,利用核酸杂交可检测特定的核苷酸片段或研究同源性等。,单链DNA与单链RNA杂交（DNA-RNA）,单链RNA与单链RNA杂交（RNA-RNA）,用硝酸纤维素膜作为支持物进行杂交,1975年英国E.M.Southern首创的Southern blotting（Southern印迹）,原理,方法,探针：作为检测用的已知DNA序列或RNA序列的片段,1977年首创Northern blotting（Northern印迹）,Western blotting（Western 印迹）,（七）凝胶电泳,核酸
17、研究中最常用的方法,优点：简单、快速、灵敏、成本低。,通过凝胶电泳,（1）可进行核酸分离，知道核酸的纯度。,（2）测定分子大小。,（3）估计核酸的构象。,凝胶电泳兼有分子筛效应和电荷效应,1琼脂糖凝胶电泳（agarose gel electrophoresis）,琼脂糖凝胶电泳的迁移率主要与分子大小、胶浓度、核酸构象、电流等有关。,2聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis）,用于分析RNA或Mr小于1000bp的DNA片段,适用于大分子核酸，一般用于DNA分析。,（一）DNA的生物功能,1DNA与遗传,（1）DNA是主要的遗传物质,间接证据,直
18、接证据,八、核酸的生物功能,细菌转化作用（transformation）,肺炎球菌（pneumococcus）,1928年细菌学家Griffith 细菌毒性实验,1944年Avery细菌转化实验,转化作用：,转化作用的物质称转化因子,从一种细菌中得到DNA通过一定途径进入另一种细菌，从而引起后者遗传特性的改变。,噬菌体感染实验,1952年美国Hershey 噬菌体感染实验,转导作用（transduction）,人工合成基因的表达,3.DNA与遗传性疾病、癌变的关系,（1）镰刀状红细胞贫血病的DNA点突变,（2）白化病的基因缺失,（3）癌变,（二）RNA的生物功能,1RNA与蛋白质的生物合成,（
19、1）mRNA与遗传密码,遗传密码（genetic code）,密码子（codon）,mRNA的主要功能,（2）tRNA的作用,tRNA的作用是多方面的，它接受氨基酸、携带氨基酸，把氨基酸转运到核糖体上，然后按照mRNA上的密码顺序装配成多肽或蛋白质。,tRNA必须识别相应的氨基酸和识别mRNA上相应的密码子。,tRNA怎样识别相应的氨基酸:主要靠高度专一的氨 酰-tRNA合成酶。,tRNA怎样识别mRNA上相应的密码子,（3）rRNA的作用,详见网上参考材料,九、核酸的分离、纯化和核苷酸的制备,（一）核酸的分离、提取通则,为了得到完整的大分子核酸，一般要注意3点:,1保持低温（04）。,2防止
20、过酸、过碱，避免剧烈搅拌。,3防止核酸酶的作用。,抑制DNase：,可加柠檬酸钠、EDTA等金属螯合剂；或加去污剂 十二烷基硫酸钠（SDS）；或加蛋白变性剂。,抑制RNase：,（1）实验器皿高温，或高压灭菌，不能高压灭菌的用 具用0.1%二乙基焦碳酸盐（diethyl pyrocarbonate,DEPC）处理。,（2）加强的蛋白变性剂如硫氰酸胍、异硫氰酸胍等。,（3）加核糖核酸酶阻抑蛋白（RNasin）等RNase的抑制剂。,（二）大分子DNA的提取,1材料的选择,2细胞破碎,3DNA-蛋白质（DNP）的提取,真核细胞DNA与蛋白质结合成核蛋白（DNP），RNA与蛋白质结合成RNP，而且D
21、NP和RNP常常混在一起。利用DNP和RNP在不同浓度NaCl中溶解度的不同来分离DNP和RNP。,可用1mol/LNaCl溶液提取DNP。,相 对 溶 解 度,NaCl（mol/L）,DNP在NaCl中的溶解度,4去蛋白质,（1）SDS,（2）苯酚法,（3）氯仿法,（4）酚:氯仿:异戊醇25:24:1,5沉淀DNA,6去杂质,（1）去RNA,（2）去多糖,7进一步纯化,生物材料,DNP（RNP）,DNP,纤维状DNA,较纯DNA,纯DNA,*原核生物的DNA是裸露的，与蛋白质结合不多，分离纯化要简单些。,破细胞,1.0mol/L NaCl*,去蛋白质,酒精沉淀,去RNA,柱层析，电泳,密度梯度离心,去多糖,（三）RNA的提取,1不同种类RNA的提取,2大分子RNA的提取,（1）酚提取,（2）酚-氯仿-SDS法,3mRNA的提取,4工业上制备RNA,（1）稀碱法,（2）浓盐法,（四）核酸纯度鉴定,1.A260/A280,2.电泳,（五）核酸含量的测定,1.定磷法,2.定糖法,3.紫外吸收法,（六）核苷酸的制备,1碱水解,2酶水解,3.自溶法,
