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1、,核酸提取与鉴定,一、核酸的理化性质 核酸可分为核糖核酸(简称RNA)和脱氧核糖核酸(简称DNA)。DNA是储存、复制和传递遗传信息的主要物质基础。,1、核酸的酸碱性质 核酸含有酸性的磷酸基和碱性的含氮的碱基，因此核酸是两性的电解质，具有等电点。但磷酸基酸性相对较强，所以核酸通常表现为酸性。在一定的pH下，核酸能发生两性电离，从而使得核酸带上电荷，具有电泳行为。,2、核酸的溶解度与黏度 DNA与RNA都是极性化合物，都微溶于水，而不溶于乙醇、乙醚、氯仿等有机溶剂。DNA的黏度很大，当DNA溶液受热或其他因素作用下，发生双螺旋结构变为无规则线团结构，此时黏度降低，因此可用黏度做为DNA变性的指标
2、。,3、核酸的紫外吸收 由于核酸的组成成分是嘌呤碱、嘧啶碱（带有共轭双键）具有强烈的紫外吸收，所以核酸表现出强烈的紫外吸收性质，其最大的吸收峰在260nm。,3、增色效应(hyperchromic effect)是指因高分子结构的改变，而使摩尔吸光系数增大的现象,核酸变性时，双螺旋结构被破坏，嘌呤碱、嘧啶碱暴露出来，其紫外吸收能力增强。,4、核酸的变性、复性及杂交,核酸的变性:在物理和化学因素的作用下，维系核酸二级结构的氢键和碱基堆积力受到破坏，DNA由双链解旋为单链的过程。核酸的降解:核苷酸间的磷酸二酯键的断裂引起核酸变性的因素有：高温、强酸强碱 有机溶剂、尿素等,当呈双螺旋结构的DNA溶液
3、缓慢加热时，其中的氢键便断开，双链DNA便脱解为单链，这叫做核酸的“溶解”或变性。在适宜的温度下，分散开的两条DNA链可以完全重新结合成和原来一样的双股螺旋。这个DNA螺旋的重组过程称为“复性”。热变性一半时的温度称为熔点或变性温度，以Tm来表示。DNA的G+C含量影响Tm值。由于GC比A=T碱基对更稳定，因此富含GC的DNA比富含A=T的DNA具有更高的熔解温度。根据经验公式xG+C=（Tm-69.3）2.44可以由DNA的Tm值计算G+C含量，或由G+C含量计算Tm值。,（二）复性 变性DNA在适当条件下，可使两条分开的单链重新形成双螺旋DNA的过程称为复性（renaturation）。当
4、热变性的DNA经缓慢冷却后复性称为退火（annealing）。DNA复性是非常复杂的过程，影响DNA复性速度的因素很多：DNA浓度高，复性快；DNA分子大复性慢；高温会使DNA变性，而温度过低可使误配对不能分离等等。最佳的复性温度为Tm减去25，一般在60左右。离子强度一般在0.4mol/L以上。,（二）基因 基因(遗传因子)是具有遗传效应的DNA片段，基因支持着生命的基本构造和性能。,编码区：是可以被转录的区域非编码区：不可以被转录的区域密码子：遗传密码(英文：Geneticcode)是一组规则，将DNA或RNA序列以三个核苷酸为一组的密码子转译为蛋白质的氨基酸序列，以用于蛋白质合成。起始密
5、码子为AUG(甲硫氨酸)；终止密码子：UAA、UAG、UGA.,细胞DNA的提取,过程：,裂解：破碎细胞，使细胞中的核酸游离在裂解体系中,纯化：使核酸与其它杂质彻底分离，如蛋白质、盐等,总原则：应保证核酸一级结构的完整性；排除其它分子的污染。,鉴定：浓度、纯度、分子量、测序（技术：分光光度技术、凝胶电泳技术等）,1、植物样品 新鲜组织先用无菌生理盐水洗；干药材除去霉点，无菌水浸洗；,（一）样品预处理（获取分散细胞）,捣碎或剪碎；加液氮研磨成粉状。,2、动物样品,（1）组织样品：,新鲜样品，生理盐水洗，直接使用（或分装、-70/液氮低温保存）；,甲醛固定组织要先去掉甲醛；,石蜡包埋组织要经过组织
6、切片和二甲苯脱蜡等处理。,（2）血细胞样品：,（3）培养细胞：离心，弃细胞培养液；用缓冲液多次漂洗；,来源：新鲜血液或者冻贮血液；,抗凝剂：一般用EDTA-Na2或柠檬酸钠（枸橼酸钠），不可使用肝素；分离：红白细胞，一般用明胶，加缓冲液悬浮白细胞。（血清DNA是研究肿瘤的材料之一）,3、微生物培养物样品离心获取菌体细胞，加缓冲液洗涤，加缓冲液悬浮菌体细胞。,4、微生物混合样品用缓冲液悬浮菌体，低速离心，沉淀杂质。高速离心获取菌体细胞。用缓冲液洗涤菌体细胞。加缓冲液悬浮菌体细胞。,（二）提取用具预处理,1、DNA提取用具的处理 要求无菌；试剂、器材高压干燥等进行无DNA酶处理。,2、RNA提取用
7、具的处理,要求无菌，防止二次污染。RNA易被RNase水解，RNase无处不在且耐高温，提取条件要求严格。,二、真核生物基因组DNA的常规提取,裂解细胞，溶出DNA,除去杂质,重新溶解DNA,沉淀、浓缩DNA,破碎细胞，溶解DNA：用提取液（裂解液）破坏细胞壁、细胞膜和核膜。微生物样品提取液：含表面活性剂SDS、溶菌酶等动物样品提取液：含SDS、蛋白酶K等植物样品提取液：含CTAB核酸酶可被Ca2+、Mg2+等激活，提取液均含有螯合剂（如EDTA，柠檬酸等），螯合这些离子。,2、除去杂质（主要是蛋白质）,（SDS，破膜、蛋白质变性沉淀）苯酚抽提蛋白质氯仿抽提、萃取苯酚经离心后溶液分为三层：上层
8、是核酸溶液、中间不溶物为变性蛋白质，下层是苯酚氯仿溶液。,3.沉淀DNA有机溶剂沉淀DNA：2倍体积无水乙醇（或1倍体积的异戊醇）再用75%乙醇清洗多次。4.重新溶解DNA将DNA溶于水或TE溶液。,DNA提取的一般流程,（一）核酸浓度检测,OD2601时（比色皿厚度1.0cm）双链DNA浓度为50 g/ml，单链DNA或RNA浓度为40 g/ml。DNA(g/ml)=OD26050RNA（g/ml）=OD26040,二、核酸的鉴定,（二）核酸纯度检测（紫外吸收法）,核酸在260 nm处有吸收峰，蛋白质在280 nm有吸收峰核酸的纯度用OD260/OD280比值表示。,DNA样品：OD260/
9、OD280 1.8，DNA纯度高OD260/OD280 1.8，含RNA，或DNA部分降解OD260/OD280 2.0，RNA出现降解,（三）核酸完整性检测,核酸样本的完整性和分子量可通过琼脂糖凝胶电泳测定（RNA常采用甲醛琼脂糖变性凝胶电泳），溴化乙锭染色，紫外灯观察。,凝胶上RNA存在处可观察到清晰的条带。完整性良好的总RNA应该清晰地看到28s rRNA、18s rRNA、5s rRNA的三条带，其中28s rRNA的亮度应为18s rRNA的两倍，5s rRNA 较弱。,电泳：带电颗粒在电场的作用下发生迁移。,根据电泳支持介质分为,琼脂糖凝胶电泳：多用于鉴定较大核酸片段（0.160
10、kb）聚丙烯酰胺凝胶电泳：用于鉴定较小的核酸片段（501000 bp）,电泳,琼脂糖凝胶电泳,琼脂糖是从琼脂中提纯出来的一种多糖。凝胶具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度，低浓度的琼脂糖形成较大的孔径，而高浓度的琼脂糖形成较小的孔径。,琼脂糖凝胶电泳有许多优点：操作简单，电泳速度快，分离核酸范围广；电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好；电泳后区带易染色，便于定量测定；可用于核酸的纯化和分离（电洗脱法）；可制成干膜可长期保存。,RNA可以使用非变性或变性凝胶电泳进行检测。在非变性电泳中，可以分离混合物中不同分子量的RNA分子，但是无法确定分子量。,RNA变性电泳：RNA为单链分子，局部形成发卡结构，直接电泳无法确定分子量。只有在变性情况下，RNA分子完全伸展，迁移率才与分子量成正比。方法：电泳前样品保温60，RNA分子伸展。凝胶中加有甲醛，使RNA在电泳过程中保持单链结构。,操作流程大致为：凝胶的制备加样电泳染色观察和拍照,电泳缓冲液：TAE、TBE（用于电泳和制胶）,上样缓冲液：,制胶,加样,
