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1、实验七 基因片段的亚克隆(DNA的酶切、回收和连接）,一.实验目的掌握DNA酶切的基本原理。学习和了解限制性内切酶的使用方法。学习和掌握DNA片段胶回收的方法,二.实验原理 1.核酸限制性内切酶是在原核生物中发现的一类专一识别双链DNA中特定碱基序列的核酸水解酶，它们的功能类似于高等动物的免疫系统，用于抗击外来DNA的侵袭。现已发现几百种限制性内切酶，它们以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键，产生的DNA片段5端为P，3端为OH。由于限制性内切酶能识别DNA特异序列并进行切割，因而在基因重组、DNA序列分析、基因组甲基化分析、基因物理图谱绘制及分子克隆等技术中收到广泛应用。,2.DNA的酶切反应
2、分子生物学中经常使用的是II型限制性内切酶。它能识别双链DNA分子中特定的靶序列（48bp),并在该序列内切断DNA，形成特有的粘末端或平端。,3.DNA的连接在T4DNA连接酶的作用下，平端或带有相同粘末端的DNA分子可以连接上。DNA连接酶的作分三步：T4DNA 连接酶与辅助因子ATP形成酶-AMP复合物。酶-AMP复合物再结合到具有5-磷酸基和3羟基切口的DNA分子上，使DNA腺苷化。产生一个新的磷酸二酯键，把缺口封起来。,三.试剂与器材一试剂限制性内切酶EcoRI,HindIII；10内切酶缓冲液T4DNA连接酶；10连接酶缓冲液电泳缓冲液（0.5TBE或1TAE）琼脂糖；溴酚兰；溴化
3、乙锭(工作浓度0.5g/ml)酚；氯仿；无水乙醇；70%乙醇；灭菌双蒸水,Note:Concentration:20,000 and 100,000 units/ml.Assayed on lambda DNAStorage Conditions:250 mM NaCl,10 mM Tris-HCl(pH 7.4),0.1 mM EDTA,1 mM dithiothreitol,0.5mg/ml BSA,and 50%glycerol.Store at-20CDiluent Compatibility:Diluent BHeat Inactivation:65C for 20 minutesN
4、ot sensitive to dam,dcm or mammalian CpG methylationConditions of low ionic strength,high enzyme concentration,glycerol concentration 5%or pH 8.0 mayresult in star activity,双酶切buffer的选用,二实验器材1电泳仪、电泳槽、紫外检测仪、摄影设备2恒温水浴槽,四.操作步骤酶切反应 设计酶切体积为2030l，计算清楚酶切系统中各成分的用量，清晰做好记录，如果是同一条件下进行多个酶切反应，建议统一加好共同的组分后，分装；先加入
5、正确体积的无菌双蒸水，加入1/10体积的10 x酶切缓冲液，混匀；在冰浴条件下加入适量的限制性内切酶；加入适量的DNA样品；弹匀，短暂离心；,置所用限制性内切酶最适温度水浴中，酶切13小时，酶切过夜则建议改用稍大的酶切体积，以避免水分蒸发过多影响的酶切体系各组分浓度改变过大;置65水浴中10分钟，对限制性内切酶进行灭活，不同的酶灭活条件可能不同，请参照说明书进行;进行琼脂糖凝胶电泳检测酶切反应的结果;反应体系：10内切酶缓冲液 2l DNA 1-1.5g 限制性内切酶 2-5单位用灭菌的ddH2O补至20l，37 1小时。可根据需要按比例放大。,pGFPuv和pBSK的酶切体系：,充分混匀后，
6、用离心机短时（10秒）离心，于37保温3-4小时或过夜，65保温10分钟使限制性内切酶失活。,五.注意事项 酶的定义:在标准条件下,1小时完全消化1g线型DNA分子所需的酶量定义为1U；影响限制性内切酶活性的生物因子：酶切割位点周围核苷酸两侧的碱基的性质；识别序列在DNA中的分布频率；与DNA的构象有关（SC,L,OC）；DNA的纯度（蛋白、氯仿、SDS、EDTA、甘油等）；,影响限制性内切酶活性的生物因子：内切酶用量不超过总反应体积的10%；消化时间适当延长有利于提高酶活性；加DNAse-free的BSA 可以起到稳定酶活性的作用；用硅化处理的器皿进行酶切可以提高酶活性；酶切所用器皿和ddH
7、2O要经过高温灭菌方可使用；DNA样品应不含重金属离子。,六.DNA片段的胶回收 电泳洗脱法 低熔点琼脂糖凝胶电泳挖块法 冻融回收法 玻璃奶回收法 柱回收法（按说明书进行）,Gel ExtractionProtocol,胶回收后用30-50 l无菌双蒸水洗脱DNA片段，取1-5 l进行电泳检测，取2-5 l测定OD260nm下的光吸收值，计算DNA的浓度。注：1 OD(260nm)相当于双链DNA浓度为50 g/ml,七.胶回收注意事项 将电泳槽用ddH2O反复清洗干净,倒入新鲜配制的灭菌电极缓冲液；根据点样量制备合适厚度的琼脂糖凝胶板；切胶时尽可能切掉不含DNA片段的凝胶；要尽量减少DNA在
8、紫外下的照射时间以减少对DNA的损伤；熔胶要完全。,周四：熟悉实验原理及步骤，清洗三角瓶、量筒等器皿，装枪头，1.5/0.5 ml离心管，装牙签及配溶液等 50TAE:500 ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0):500 ml 1mol/L Tris.Cl(pH8.0):500 ml 0.1mol/L CaCl2:500 ml ddH2O:每组100 ml 5 mol/L NaOH:100 ml 配LB培养基 液体：全班1000 ml 150 ml4 瓶（Amp+），用于两个质粒的接种 100 ml 4瓶(Amp-)，留做感受态细胞 固体（含1.5%琼脂粉）：每组100 ml，共12
9、00ml，可一起配再分装 每组倒5个平板（Amp+），用于次周转化灭菌。,八实验安排,周五：用Kit 提取质粒DNA，倒琼脂糖凝胶板（1%），进行琼脂糖凝胶电泳和浓度测定每人分别提取pGFPuv、pBSK质粒 各一管，每管60l取1-2l电泳，1-5l用dd H2O稀释后 在紫外分光光度计下测 OD260及OD280，并计算浓度对质粒酶切过夜周六：酶切样品琼脂糖凝胶（1%）电泳用Kit对酶切后的DNA（pBSK 大片段和GFP基因片段）片段进行胶回收每组用一个柱子回收电泳检测胶回收情况，用紫外检测回收 DNA的浓度后，存放于-20冰箱中,八实验安排-续,九.DNA片段的连接,根据目的片段和载体大小，以等摩尔比（载体DNA：插入DNA片段=1:2 1:3）计算各自DNA加样量,连接体系：,台式离心机离心10秒以混合均匀，16连接4小时至过夜，连接产物存放于4或直接转化细菌。,
