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实验八,重组质粒的酶切鉴定,一、实验目的,学习和掌握重组质粒的少量酶切、电泳及分析插入DNA片段的大小,二、实验原理,EcoRI&PstI,BamHI单切,器具和材料1.5ml EP管,移液器及枪头(10、50l)恒温水浴、电泳仪、电泳槽重组质粒pMD18-T,三、实验器具、药品,试剂,限制酶:BamHI、EcoRI和PstI酶切buffer:10K、10HDNA marker:-Hind琼脂糖,1TAE,上样buffer,1.酶切反应步骤 ddH2O于EP管10buffer质粒DNA限制酶混匀,离心5s37,5065水浴10,四、实验步骤,(1)单酶切反应,BamHI(15U/l)组/4人;30,50,(2)双酶切反应,EcoRI 37,50,2.凝胶电泳检测,0.8%Aga,30ml TAE,煮沸冷却至55,2l EtBr倒胶,插梳子,凝固202l上样液+样品100V电泳,观察,酶切失败的可能原因,不全切或基本未切缓冲体系不合适酶量过多样品杂质含量高DNA被降解痕量DNase,注意事项,吸量要准确最后加酶冰上操作勿触管盖内面EP管盖严,五、作业,思考题P140 2、5,
