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1、HER2基因扩增FISH 典型特殊案例分享,NP-BIO-2015.02-008 Valid Until 2017.02,声明 本幻灯片仅以学术交流为目的。处方请参考国家食品药品监督管理总局批准的药品说明书。,专业资料，仅供医药卫生专业人士参考,背 景,对来自同一中心的病例（病例数1700）进行研究，发现将近10%的原位杂交结果呈现异常信号形式1。对其中最常见的形式进行了阐释，为诊断者提供了报告指南，并对未来的研究提出了建议。“典型的特殊情况”一致性管理，使最终可以得到分子及生物化学证据的支持。,1.Am J Clin Pathol 2012;137:595-605,HER2 检测标准流程,流
2、程图,FISH 评判标准,ASCO/CAP于2013年10月联合发布了新版乳腺癌HER2检测指南1,2中华病理学杂志于2014年4月发布了新版中国乳腺癌HER2检测指南3,1.Journal of Clinical Oncology.2013 Oct 7.Epub ahead of print2.Arch Pathol Lab Med.2013 Oct 7.Epub ahead of print3.中华病理学杂志2014年4月第43卷第4期,FISH 评判标准,中国乳腺癌HER2检测指南（2014版）1：,1.中华病理学杂志2014年4月第43卷第4期,FISH 评判标准,中国乳腺癌HER2检
3、测指南（2014版）1：,1.中华病理学杂志2014年4月第43卷第4期,Note,本幻灯收录的病例，均发表于ASCO/CAP指南（2013）和中国指南（2014）发表之前原作者在讨论病例时，仍然使用了旧版指南中的FISH判读标准。但是新旧指南的变化并不影响作者的结论。为保证论述的完整性，本幻灯仍然保留原作者的讨论原文。读者在阅读时，应对新旧指南的变化予以注意。,CASE 1,异质性扩增1,1.Am J Clin Pathol 2012;137:595-605,A，图中显示的是两组独立的肿瘤细胞群（由虚线隔开）；一组明显无扩增现象，表明HER2基因的缺失（黄色箭头所示），另外一组的HER2/C
4、EP17比率值2.2，表现为基因扩增（白色箭头所示）。,病例1：简单的异质性扩增在该病例中，来自同一组织的肿瘤细胞，于肿瘤组织切片内，肿瘤细胞可能会立即紧挨放置或在各自的肿瘤区域内。一组很明显无扩增现象，另一组的HER2/CEP17比值大于2.2，明显说明基因扩增。,Solution,至少计算每区域中的20个肿瘤细胞,该肿瘤包含两个独立的乳腺肿瘤克隆体，其中一个呈现HER2基因扩增现象，另外一个无扩增现象。,将该病例称为呈现“异质性扩增”的HER2扩增模式，在报告中分别列出两组的HER2/CEP17比值。,Solution,CASE 2,“混合”1,1.Am J Clin Pathol 201
5、2;137:595-605,B，HER2基因和CEP17拷贝数都有所增加，扩增（HER2/CEP17比率值2.2，白色箭头所示）和非扩增细胞看起来混合在一起，分散在肿瘤区域。有些细胞的比率正常，有些扩增明显，但是不可能将两个分开的区域区分开来。,病例2：复杂的异质性扩增“混合”的扩增和非扩增肿瘤细胞在该病例中，扩增和非扩增细胞看起来混合在一起，并分撒在肿瘤区域内。有些细胞看起来正常，一些明显扩增，但是无法区别两个不同的区域。,Solution,计数3个区域的60个细胞，并在一张报告单上分别记录扩增和非扩增细胞数目。,该肿瘤包含混合的乳腺癌克隆体，一个呈现HER2基因扩增现象，另一个呈现非扩增现
6、象。,将该病例称为潜在的“混合异质性扩增模式”，并列出每个计数细胞的HER2/CEP17比值平均值（或在不区分扩增/非扩增的前提下列出每个区域的R2/CEP17比值平均值）。然而，虽然现有的数据显示小百分比的扩增细胞并不足以说明HER2扩增的存在，也要列出混合肿瘤群体中扩增细胞（比值2.2）的百分比。根据当下的指南，对于这些病例，当所有计数细胞的HER2/CEP17比值平均值过2.2时，可以称之为有HER2扩增现象。,Solution,CASE 3,孤立扩增的癌细胞1,1.Am J Clin Pathol 2012;137:595-605,C，在非扩增细胞占主导地位的背景下，我们可以看到一个孤
7、立的扩增细胞（白色箭头所示），扩增水平较高（比率值3.0）。,病例3：孤立扩增的癌细胞在该病例中，在非扩增细胞占肿瘤组织主导地位的大背景下，出现比率值明显较大（比值3.0）的孤立细胞。值得注意的是，扩增细胞中的信号显而易见，真实可靠，没有人为处理的痕迹。也许可以逼真地人为模仿一些信号，但多波长的荧光信号（即自荧光）则难以模仿。因此，对之评价前，应该确保这些信号在4，6-二脒-2-苯基吲哚示踪剂下或液体过滤器下不显绿色。如果这些信号是真的，就应该计数。,Solution,只有在细胞明显扩增的情况下才能记录孤立扩增癌细胞的存在。该类细胞的预后价值尚不明确，但是当下的证据表明，百分比较小（30%）的
8、情况下，其对结果没有影响。列出所有计数细胞的HER2/CEP17比值平均值，并根据该值进行全面的诊断（扩增或非扩增）。例如，在该病例中，HER2基因为非扩增。,对区域内的扩增或非扩增细胞进行评分时，应该公正评价，不偏不倚。,该肿瘤可能会包含HER2扩增的孤立细胞，其显著性目前尚未明了。然而，当下的证据表明其对预后影响有限。我们对之的完全意义尚不明确。,研究建议人们认为，获取足够的证据来支撑该孤立癌细胞的预后影响是不大可能的。对该类细胞进行生物学的单细胞分析，可能会得到一些信息（运用激光捕获纤维切割），但仍无法阐明其对患者疾病进程的影响。,Solution,CASE 4,整条17号染色体的缺失1
9、,1.Am J Clin Pathol 2012;137:595-605,A和B，肿瘤细胞都只带有HER2和CEP17的信号，暗示整条17号染色体区域的完全缺失。,病例4：整条17号染色体的缺失在该病例中，在整个肿瘤细胞视野范围内仅可观察到HER2和染色体17CEP信号；实际上，看起来每个细胞都缺失一块整条17号染色体的区域。仔细检查发现，相毗邻的正常细胞仍有1到2个CEP17和HER2信号。17号染色体CEP的拷贝数目平均值为1.02（标准差，0.13），HER2基因的拷贝数目平均值为1.06（标准差，0.25）；HER2/CEP 17比值为1.05.,Solution,根据英国相关指南进行
10、评分。,尽管该病例异常，很明显，这是一个非扩增肿瘤的例子。,将该病例称之为HER2非扩增现象，并附上单倍体或17号染色体缺失的可能性。,研究建议可以运用比较基因组杂交（CGH）检测缺失的亚染色体区域，该区域的缺失可能会导致HER2和CEP17的缺失。,Solution,CASE 5,CEP17 信号缺失11,1.Am J Clin Pathol 2012;137:595-605,C 和D，显示的是肿瘤细胞中，HER2拷贝数正常，而17号染色体CEP信号缺失的现象。结果为临界的HER2基因扩增。,病例5在该病例中，肿瘤细胞缺失17号染色体CEP信号（又可看到毗邻的正常细胞呈现正常的信号模式）。H
11、ER2拷贝数正常，仅可观察到17号染色体CEP17信号的缺失。结果是，HER2基因扩增与否不大明确，HER2拷贝数目平均值为1.98（标准差，0.62），CEP17拷贝数的平均值为1.02（标准差，0.13）；HER2/CEP17 比值为1.95。计数的60个细胞中，该病例可称之为“临界但非扩增”现象，根据美国临床肿瘤学协会/美国病理学家研究院指南，该病例可称之为不确定。如果60个细胞中，有6个（10%）及以上细胞的HER2/CEP17比值为2.20，即使每个细胞中HER2拷贝数平均值小于2，根据美国病理学家研究院指南，也将之视为呈现异质性HER2基因扩增现象。然而，相关研究结果显示，HER2
12、/CEP17比值为2.2及以上的细胞数高达30%时，对结果没有影响,Solution,从HER2/CEP17比值来看，该病例为非扩增肿瘤。HER2复制水平低下，是否出现如例4所示的整条17号染色体缺失，尚不明确一条染色体上带有CEP17卫星的特定着丝粒区域缺失与否也有待查明。很可能这是染色体重排和失衡的结果。其它可能性（也可见于细胞遗传学中的其它实体瘤）包括1条17号染色体的缺失（17号染色体长臂上一个等臂染色体的形成）和不平衡置换（保留包含17q物质和HER2核心的衍生染色体）低水平“扩增”的小百分比(30%)细胞的存在，没有显著性差异，不予以报告。呈现17号单倍体的病例对曲妥珠单抗的反应性
13、较差。,因为其为低水平扩增事件，至少要计数60个细胞。,Solution,根据扩大细胞计数量，使之不少于60得到的结果，该病例可称为非扩增现象。可以在附录中注明CEP17正常的计数。比值2.2的小数量细胞的出现无明显差异，不应该对其进行报告。,研究建议进行大批比较基因组杂交/多重连接探针扩增(CGH/MLPA)来测定17号染色体的拷贝数和HER2基因扩增的地位。,Solution,CASE 6,CEP17信号的缺失21,1.Am J Clin Pathol 2012;137:595-605,A 和 B，肿瘤细胞中仅有一个CEP17的拷贝体，然而，HER2拷贝数增加，导致扩增比值。,病例6在该病
14、例中，CEP17的出现与例5具有可比性，暗示肿瘤细胞中1个CEP17信号的缺失（再次与呈现正常信号模式的正常细胞毗邻）。信号缺失或减少仅涉及CEP17信号；然而，该病例中也呈现出HER2拷贝数目的增加。结果为，HER2基因扩增，HER2的拷贝数目平均值为5.75（标准差，0.9），CEP17拷贝数为1（标准差，0.0）；HER2/CEP17比值为5.75。,Solution,从HER2/CEP17比值看，很显然，其为扩增细胞。是否出现如例5所示的整条染色体缺失（HER2在剩下的染色体上扩增），或是否有特定的着丝粒区域缺失（在一条染色体包含CEP17卫星），尚不清楚。如果后者正确，该类型的病例中
15、不包括真正扩增。然而，我们当今的观点是，这代表了带有HER2基因扩增的17号染色体单倍体数目的减少由于染色体组型高度复杂，17号染色体长臂多次拷贝，HER2扩增可出现在保留的染色体上或增加拷贝的HER2基因。,没有证据表明计数多余的细胞会改变诊断结果，根据指南计数至少20个细胞。,Solution,该病例为HER2基因扩增，并列出HER2/CEP17比值，应在附录注上异常CEP17出现的计数。,研究建议可以进行一系列的CGH/MLPA 来决定17号染色体数目的拷贝数和HER2基因扩增的地位。应视方案的不同，对CGH进行区别。,Solution,CASE 7,CEP17信号完全缺失1,1.Am
16、J Clin Pathol 2012;137:595-605,C 和D，CEP17信号在肿瘤细胞中看不到，然而，在正常细胞中可见(箭头所示)，在该病例中，HER2扩增地位仅由HER2拷贝数决定。,病例7在该病例中，肿瘤细胞中，所有的CEP17信号完全缺失；注意一个重要的对照是正常细胞中含CEP17。只有当正常细胞中出现CEP17信号的时候才可以明确的做出CEP17缺失的诊断。如果正常细胞中没有CEP17信号，则是原位杂家评价的技术失误。因为没有CEP17，则无法得到HER2/CEP17比值，这无疑带来了些许挑战。HER2的平均拷贝数为6.8/细胞(标准差，1.78)。,Solution,推荐所
17、有病例使用CEP17，而不推荐使用单一的拷贝荧光原位杂交 FISH。曲妥珠单抗大型期试验的报告结果都不是以拷贝数目来记录的，相关研究也说明拷贝数目在HER2基因扩增指导中作用不大。然而，在极少数情况下，当染色体的着丝粒区域缺失时，建议以大于等于6的拷贝数来记录缺失CEP17区域的HER2扩增现象。这并不是最佳的记录方法，而且不能根据以往的证据，延伸到非缺失CEP17的病例。然而，在这些特殊的病例中，当下并不推荐分析CEP17,计数肿瘤细胞中的HER2基因拷贝数。证据表明诊断结果与计数细胞多少无关。根据指南计数细胞的最小值为20。,Solution,报告建议仅根据HER2基因拷贝数（仅当HER2
18、基因数目6/细胞时），将该病例为扩增。并做个注释以说明和所有细胞中的CEP17信号缺失。,研究建议进行大批的CGH/MLPA 可以阐明基因损伤导致的CEP17信号缺失，并决定HER2基因扩增地位的有无。使用替代17号染色体的探针（端粒探针）进行荧光原位杂交FISH分析也具有一定的价值。,Solution,CASE 8,信号重叠共存1,1.Am J Clin Pathol 2012;137:595-605,HER2和 CEP17拷贝数目很高。A和B，HER2和CEP17 的拷贝数目非常高，信号重叠共存，呈现出黄色融合信号。,病例 8该病例中，细胞内呈大量的HER2和CEP17共存的信号模式，用三
19、带通滤波器观察时，红绿融合的信号呈黄色。在高强度下，可以观察到红绿信号重叠。使用单带通滤波器，可以确认信号的重叠共存 并排除人为因素(荧光通过所有的带宽)。对该病例进行诠释有些困难，因为其HER2/CEP17 比值为1.04，HER2和CEP17信号的计数平均值分别为24.3和23.43，根据传统标准应为非扩增。然而，HER2/CEP1的高拷贝值却意味着该病例高度异常。,Solution,用单色过滤器对HER2和CEP17信号进行评分，注意区域内细胞的匹配，以确保红绿信号的精确计数。根据指南计数至少20个细胞；计数多余的细胞不可能改变诊断结果。,其为异常病例，因为即使HER2/CEP17比值表
20、现为非扩增模式，HER2和CEP17都有很高的拷贝数。鉴于有证据表明HER2/CEP17扩增子的程度不同，11我们认为，这些病例可能代表了HER2扩增子扩展到CEP17着丝粒外围区域。我们认为这些罕见的病例解释为扩增现象。信号模式可解释为HER2扩增子延伸到着丝粒，并整合了着丝粒周边区域，导致了CEP17信号与HER2信号的重叠共存。已有初步证据证明，带有扩展HER2扩增子的患者可能会对曲妥珠单抗12的反应敏感性降低；然而，该假设还未得到进一步证实。,Solution,该病例应称之为基于HER2拷贝数的着丝点和相关平衡的CEP17拷贝数的共扩增，并在报告中注明HER2 和CEP17信号的重叠共
21、存现象。,研究建议要对一系列此类病例进行CGH/MLPA，以验证CEP17和HER2重叠共存的设想。,Solution,CASE 9,信号分离1,1.Am J Clin Pathol 2012;137:595-605,C和D，HER2和CEP17的拷贝数都增加了，但信号分离。,病例 9在该病例中，HER2 和CEP17的拷贝数很高，但呈现的是非重叠的分离信号。从HER2/CEP17比值看，为非扩增模式(1.12)；然而，此图却显示，HER2 和 CEP17的拷贝数目皆有升高，分别为7.45和6.65。,Solution,因为HER2/CEP17 比值显示为非扩增，该病例解释起来可能看似简单直接
22、；然而；HER2和 CEP17 信号却显示较高的拷贝数。HER2 拷贝数目6（较为多见，但不大整齐一致），则提示HER2扩增现象，通过单一拷贝计数法分析，则将之称为扩增现象。从遗传学角度看，HER2和CEP17拷贝数目增加到该水平，明显而平衡，其根本机制尚不清楚，但也不可能反映出17号染色体的多个完整无缺的复制。而因为这些病例的真正的分子机制不确定性，在解读FISH结果时，仍有做出错误诊断的巨大空间。在缺失明确证据（如HER2/CEP17信号共存）证明HER2/CEP17信号共扩增时，很难认定其为真正的HER2扩增现象。事实上，这些病例可能代表了带有亚染色体复制病例的混合，而且，其中一小部分病
23、例可能为真正扩增。然而，目前，仍没有足够的证据表明这些病例可以从治疗中获益。,对HER2和CEP17信号进行评分，根据相关指南，计数细胞至少为20个。,Solution,研究建议应对大量此类病例进行一系列的CGH/MLPA分析，测定该类病例的根本遗传机制，并判断其是否代表了HER2的扩增。另外还可以看一下HER2 mRNA的定量聚合酶链式反应来确定基因的扩增状况。,根据现行指南，该病例该记录为非扩增。报告中应对HER2 和CEP17 的高拷贝数进行评价。,Solution,CASE 10,黄色融合信号1,1.Am J Clin Pathol 2012;137:595-605,A：HER2和CE
24、P17信号共存导致的黄色融合信号。当捕获HER2(B)CEP17(C)信号，并将之作为独立的图像而进行比较时，在核的同一个区域信号呈明显的共存现象。,HER2 和CEP17的共扩增HER2/CEP17共扩增虽然很少见，在当今诊断界仍是人们讨论的重点话题。在本次研究中，1787例病例中仅有2例（0.1%）呈CEP17和HER2“共存”现象。HER2和CEP17的FISH标记重叠，呈现出黄色的“合并”信号，即为CEP17和HER2 的“共存”现象。然而，更多的病例，22 例(1.2%)，呈现出高HER2拷贝数（6/细胞）和CEP17复制信号，以至于整体的HER2/CEP17比值不超过2.2。由于证据不足，难以支撑诊断结果，所以阐明这些病例仍有难度。,Question,1-图片中的问题所在？A 信号分离 B 多倍体,2-此案例是否扩增？A 扩增 B 非扩增,We Innovate Healthcare,
