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1、HRM高分辨率熔解曲线分析技术,百替生物-Dendi2014-07-10,HRM(High Resolution Melting):于2003年发明，是一项近年来备受关注的创新的技术，实现了通过研究PCR产物依赖于序列的熔解温度而对PCR产物进行鉴定。可用于检测样品中存在的双链DNA的单核苷酸多态性（SNPs）基因变异（Mutation）、多态性（Polymorphisms）和表观遗传学（Epigenetic）差异。,RealTime PCR,HRM,TM值：当前温度下50%的双链解链为单链,HRM与RealTime PCR的异同点：,需要加入荧光染料检测获取荧光信号采用的染料类型不同（Syb
2、r和LC）荧光信号检测时机不同分辨率不同数据处理方式不同,饱和染料有效避免了检测荧光信号中的假阳性新的饱和染料降低了传统染料对PCR反应的抑制作用LC GREEN,高分辨率：DNA的熔解曲线取决于DNA碱基序列。理论上任何一个碱基的改变，都会造成TM值的差异，但是单个碱基改变造成的差异是极小的，通常只有零点几度。因此要精确检测TM值的差异，就至少需要保证每0.1获取一次荧光信号。LightScanner,HRM原理示意图,HRM的技术优势：1.整体操作方法简单，检测灵敏度高，可检测出单个碱基的改 变，检测效率高，5-10分钟即可完成对96/384孔板的检测。2.从PCR到检测荧光信号，整个过程
3、在同一个管中进行，最大 程度的避免了污染。3.无需事先知道突变位点，无需设计探针，大大简化实验设计 时间和研究成本。,HRM在医学领域中应用：1)疾病相关基因（癌基因）特定区段突变位点的扫描，新突 变的发现2)HRM在序列配对中的应用。3)HRM在基因分型中的应用。4)HRM在甲基化分析中的应用。,在胃肠道间质瘤（GIST）中新发现的7个c-kit激活型(c-kit-activating)突变基因位于第11号外显子中，为从基因水平诊断GIST提供了新的方法。(Willmore et al.,2004)Anatomic Pathology在非小细胞性肺癌（NSCLC）患者中发现第19号外显子中存
4、在有(L747-P753insS)突变，为以后针对性的分子诊断以及设计药物有潜在意义。(Smith et al.,2008)Clinical Pathology,HRM在突变扫描中的应用举例,HRM在序列配对中的应用举例,Human Leucocyte Antigen(HLA)人类白细胞抗原：位于第六号染色体的短臂6P21.31区，长3600KB，根据功能和产物结构的不同分成3组：经典HLA基因、免疫功能相关基因和免疫无关基因。其中经典HLA基因与输血和移植急性排斥反应密切关联。,在器官移植中，通过检测样本的HLA，以便了解样本组织与宿主是否相容。利用HRM技术，直接观察溶解曲线，可以迅速的找
5、到最匹配的器官组织，为挽救患者的生命争取宝贵的时间。,HRM在基因分型中的应用举例,在拉米夫定抗病毒治疗过程中，病毒合成的DNA聚合酶会在YMDD序列出发生变异。利用HRM和DNA测序法同时检测45例样本，其中HRM检测结果与测序法检测结果几乎一致，符合率为93.3%。因此利用HRM大规模检测YMDD变异是简单有效的方法。（实用医技杂志 2008）,HRM在甲基化中的应用,甲基化是蛋白质和核酸的一种重要修饰，对调节基因表达，癌症、老年痴呆等许多疾病相关，因此检测甲基化在医学领域中具有重要作用。利用亚硫酸氢盐将未甲基化的DNA中的胞嘧啶转换成尿嘧啶之后，处理过的DNA产物将比甲基化的DNA产物的TM值要低，通过HRM可以将二者区分开来。,由于HRM的操作与后期数据分析简单、易懂,在多个医学研究领域收到了广泛关注并发展起来,高分辨率熔解曲线已经成为医学上DNA诊断的最为理想的解决方法。,Thank you!,
