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1、1,IL-12抗I型超敏反应的实验探究,实验目的,1.验证IL-12对Th2型免疫应答向Th1型转换，下调IgE的作用。2.探究IL-12的注射剂量对下调IgE的影响。3.探讨IL-12在治疗I型超敏反应中的前景。,实验原理,IgE的产生依赖于细胞因子IL-4，Th2细胞受变应原刺激活化分泌IL-4等细胞因子,可诱导变应原特异性B细胞增殖、分化成浆细胞，通过调节Ig类别转换等机制产生特异性IgE抗体。IL-12可刺激NK细胞分泌IFN-，并诱导Th0向Th1细胞方向分化，抑制向Th2细胞分化，减少Th2细胞以及其生成的IL-4。同时，IFN-还具有抑制B细胞合成IgE的潜在活性。从而可以达到下
2、调IgE的效果。,IFN-是Th1的特征性细胞因子，IL-4是Th2的特征性细胞因子。利用酶联免疫吸附法（ELISA)检测致敏大鼠脾淋巴细胞分泌IFN-、IL-4的表达水平,以及血浆中IgE的水平。即可验证IL-12对Th2型免疫应答向Th1型转换，下调IgE的作用。,IL-12刺激Th2向Th1转化，下调IgE,实验原理,ELISA原理,双抗夹心法测量时，抗原（抗体）先结合在固相载体上，但仍保留其免疫活性，然后加一种抗体（抗原）与酶结合成的偶联物（标记物），此偶联物仍保留其原免疫活性与酶活性，当偶联物与固相载体上的抗原（抗体）反应结合后，再加上酶的相应底物，即起催化水解或氧化还原反应而呈颜色
3、。,实验原理,动物：Wistar大鼠12只,体重200220 g，雄雌各半，随机分5组，即正常组1只、模型组1只、实验组10只。药物:鼠IL-12试剂：鸡卵白蛋白,抗鼠1gE抗体，抗鼠IL-4抗体，抗鼠IFN-抗体，酶标抗体，底物，生理盐水。仪器:微孔板，酶标分析仪，离心机。,实验材料,实验流程,1、分组2、变应原的制备与注射3、外周血采集及IL-4、IFN-、IgE的测定（ELISA）4、数据分析,1、正常组：1只 未经处理的对鸡卵清蛋白不过敏 的wistar大鼠2、模型组：1只 经鸡卵清蛋白致敏的wistar大鼠3、实验组：10只 经鸡卵清蛋白致敏的wistar大鼠 ps：模型组和实验组均
4、是用鸡卵白蛋白与氢氧化铝悬液的混合液致敏和诱发，制成的型超敏反应动物模型。,分组,1、取50 g鸡卵清蛋白制成5mL 10g/mL的溶液（溶于生理盐水中）2、制备800 g/mL的IL-12，按照下图做倍比稀释（IL-12稀释于鸡卵清蛋白中）,药物的制备,1、正常组不做处理 2、模型组和实验组于致敏两周后,腹腔内注射药物（鸡卵清蛋白+IL-12）50L,药物注射,正常组,模型组和实验组,鸡卵清蛋白IL-1250L,1、用眼眶取血法取外周血，离心取上清液,外周血采集及IL-4、IFN-、IgE的测定（ELISA）,2、ELISA 检测血浆中IL-4、IFN-和IgE的滴度,1、包被抗体：抗体（抗
5、鼠IgE抗体）用包被液稀释好后100l/孔加样，37孵育1或者4过夜，之后用超纯水洗三遍，在干燥的吸水纸上拍除多余的水分。2、封闭：加1%的脱脂奶粉，200l/孔，37放置1或者4过夜，之后甩干，不洗，此时的抗体板子可以直接使用。3、加抗原IgE：每孔加100l需要检测的IgE于已经封闭好的酶标板，小心吹除气泡，37孵育1或者4过夜，之后用PBS洗三遍，在干燥的吸水纸上拍除多余的水分。4、加酶标抗体：酶标抗体50l/孔加于酶标板，37放置1，之后用PBS洗三遍，必要时要进行适当的浸泡，在干燥的吸水纸上拍除多余的水分。5、显色：显色底物加于酶标板，100l/孔，37孵育15min后用1滴的硫酸终
6、止显色反应。6.重复ELISA实验，检测小鼠血清中IFN-和IL-4的浓度变化7.数据分析，用酶标分析仪读出血清中IgE、IFN-和IL-4的效价,ELISA(以IgE为例),预期结果,正常组：IL-4、IFN-和IgE水平很低模型组：IgE和IL-4效价较正常明显升高，效价较正常明显降低实验组：,特定浓度的IL-12对下调IgE效果最明显IL-4变化趋势与IgE相同,IFN-相反,实验讨论,一、预期外的结果,IL-12浓度过低,IL-12浓度过高,2.模型组致敏成功 个体差异、IL-12和变应原注射顺序、注射和取血距致敏的时间、注射方式、剂量。,实验讨论,效果不明显,1.模型组致敏失败 模型
7、组IgE未升高。,二、IL-12与变应原注射顺序不同-致敏前、同时或之后注射IL-12,可能导致不同的结果三、用以检测IL-4、IFN-和IgE的其他方法：RT-PCR、ELISPOT,实验讨论,前景探究,IL12对Th2型免疫应答向Th1型转换，下调IgE的作用，因此可以考虑IL-12在治疗I型超敏反应会有一定的应用价值。例如在知道超敏原的前提下可以应用IL-12来避免可预知的过敏。,参考文献,金伯泉.医学免疫学.第五版.北京：人民卫生出版社,2008周俊宜.分子医学技能.第一版.北京:科学出版社,2006胡大伟,陈顺乐,石学耕,等Th1/Th2细胞因子的失衡与狼疮活动性的研究中华风湿病学杂志,1999,3(Suppl):8-11董尉,盛军,浦燕艳,石学耕,史桂英.哮喘患儿细胞内IL-4、INF-和血清IgE测定及临床意义.中国当代儿科杂志,2002,4(2):119-120.安云芳，赵长青.变应性鼻炎鼻豁膜物质受体的研究J.中华耳鼻喉科杂志，1998，33(3):139一141.宋宁,丛斌.CCK对Th1_Th2细胞的调节作用及其机制研究.中国病理生理杂志，2007,Thank you！,
