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1、MERS-CoV的样品采集和实验室检测,一、概况,中东呼吸综合征冠状病毒（Middle East Respirtory Syndrome Coronavirus,MERS-CoV)2012年6月13日，沙特诊断首例中东呼吸综合征。追溯调查，2012年3月该病就已经在中东存在。,一、概况,2012年9月，命名为新型冠状病毒（novel coronavirus)。2013年5月23日，由国际病毒分类委员会命名为中东呼吸综合征冠状病毒（97.8%）。20多个国家有病例报告，均和中东有流行病学关联，中东以外地区尚为发现原发感染病例。,引起人类疾病的冠状病毒,人冠状病毒：HCoVOC43、HCoVHKU
2、1、HCoV229E、HCoVNL63SARS-CoVMERS-CoV,病原学,类冠状病毒的2c亚群，无包膜，单股正链的RNA病毒。和蝙蝠的CoV基因相似性70.1%，和SARS病毒的基因相似性54.9%。MERS-CoV受体 二肽基肽酶（hDPP4，也称为CD26)，位于人深部呼吸道组织。该受体宿主分布广泛：蝙蝠、人、猪,二、病例定义,疑似病例符合流行病学史和临床表现，但尚无实验室确认依据。中东呼吸综合征病例诊疗方案（2014年版）,临床诊断病例,满足疑似病例标准，仅有实验室阳性筛查结果（如仅呈单靶标PCR或单份血清抗体阳性）的患者。满足疑似病例标准，因仅有单份采集或处理不当的标本而导致实验
3、室检测结果阴性或无法判断结果的患者。中东呼吸综合征病例诊疗方案（2014年版）,确诊病例,疑似和临床诊断病例具备下述4项之一：至少双靶标PCR检测阳性。单个靶标PCR阳性产物，经过基因测序确认。从呼吸道标本中分离出中东呼吸综合征冠状病毒。恢复期血清中东呼吸综合征冠状病毒抗体较急性期血清抗体水平阳转或呈4倍以上升高。中东呼吸综合征病例诊疗方案（2014年版）,无症状感染者,无临床症状，但具备实验室确诊依据4项之一者。中东呼吸综合征病例诊疗方案（2014年版）,三、实验室检测方法,WHO推荐的实验室指南第1版：2012.12第2版：2013.9第3版：2014.6,三、实验室检测方法,病毒分离病毒
4、核酸检测血清免疫学检测,（一）标本采集注意事项,采集标本的医务工作者，必须穿戴防护MERS-CoV感染的个人防护服（PPE)。正确的采集标本，及时消毒、处理、清除污染。,采集对象,疑似病例密接者不作为采样对象。特殊情况下，当能够证明密接者连续14天接触患者时，可采集密接者上呼吸道标本。,采集的标本,下呼吸道标本的病毒载量高。上呼吸道标本亦可检出。血液标本中可检出病毒、抗体。尿、粪便标本病毒载量较低。,采样的时间,PCR法检测的标本在发病7天内采集。解除隔离前，连续2天采集。抗体检测的血液标本采集时间双份血：第1份血液标本：发病7天内；第2份血液标本：第1份血液标本采集后，间隔14-21天采集。
5、单份血：发病14天后采集。,标本采集主要材料,无菌拭子：聚丙烯纤维头的拭子。15ml的采样管、带螺旋盖的器皿。3ml病毒保存液、生理盐水等。真空采血管（红、黄、橙黄）、采血针等。,标本的采集方法,下呼吸道标本：痰：由患者直接将痰液收集于有盖能够密闭的无菌器皿内。抽吸液：将真空泵与导尿管相连。将导尿管插入鼻腔与上腭平行，打开真空装置，缓慢抽吸，同样收集另外一个鼻孔。用病毒采样液3mL 涮洗导尿管。采样液收集于采样管内。,标本的采集方法,上呼吸道标本：鼻咽拭子：垂直插入鼻腔，深入至鼻腔与咽部交汇处，旋转擦拭，再缓慢退出。将拭子头浸入病毒保存液中，挤压拭子头部数次，用力折断拭子的尾部，将拭子的尾部手
6、握部分弃去。,上呼吸道标本,咽拭子：右手握笔式持无菌拭子擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，将拭子头浸入病毒保存液中，挤压拭子头部数次，用力折断拭子的尾部，将拭子的尾部弃去。,血清标本的采集,真空采血管：选择红色、黄色、橙黄色盖的管子。根据采集对象具体情况选择采集部位，消毒，采血针穿刺充盈的静脉血管，真空采血管负压采集5ml静脉血。止血。上下颠倒采血管5次。标注采血管：编号、患者姓名等。采血管放置30min后，2h内分离提取血清。血清管标注与原采血管一致。,标本的标注及样品送检单填写,在标本采集管标签上注明：编号、姓名、标本性质。样品送检单：编号（与采样管对应）、患者基本信息、发病信息、采样信息。,（二
7、）标本的保存和运输,标本采集后尽快送到实验室。如果不能在72h小时内送到实验室，建议保存在-80冰箱或者干冰、液氮上。避免反复冻融标本。运送时，三层包装：密闭的采样管、密封罐，防破碎、针刺的采样箱。样品周围有冰排。全血应该分离血清保存4或者-20冻存。不建议保存于无霜冰箱，因为其温度变动范围大。专人专车。,标本的签收,标本保存及运输正确；标本状态完好，无泄漏；送检单填写字迹清晰、内容完整，与标本信息一一对应。送样者和收样者签字，并记录时间。,（二）核酸检测,检测的标本呼吸道标本血清,核酸检测方法,rRT-PCR法：有3种靶目标rRT-PCR检测法。有检测E蛋白上游基因（upE），有检测开放阅读
8、框1b（ORF 1b），开放阅读框1a(ORF 1a)上靶目标的方法。美国CDC发展了另外的rRT-PCR法检测MERS-CoV的核衣壳蛋白基因（N)，能够对upE和ORF 1a方法的筛选和诊断以补充。测序：RNA依赖RNA聚合酶（RdRp)或者N基因序列测序,MERS-CoV病毒核酸检测,1.检测方法实时荧光RT-PCR(rRT-PCR）技术，病毒核酸检测的特异性和敏感性最好，且能快速区分病毒类型和亚型，一般能在4-6小时内获得结果。rRT-PCR技术作为常规检测方法。MERS-CoV病毒基因序列测序,2.具体做法及实验结果判定,至少双靶标PCR检测阳性。或者单个靶标PCR阳性产物，经基因测
9、序确认。upE的rRT-PCR检测，阴性者，否定。阳性者，进一步用rRT-PCR法检测ORF 1a，阳性者，确诊。阴性者，进一步使用RdRp或者N基因序列测序法检测，如果序列不吻合，则判为阴性。核酸检测结果阴性，可再次采样检测。,rRT-PCR假阴性结果,标本质量不好；标本采集时间晚，或早于发病时间；标本处理和运送不合适；其它技术原因：如病毒变异或者PCR被抑制。,（三）血清中抗体检测方法,IFA法ELISA法NT法,血清学检测,恢复期血清中东呼吸综合征冠状病毒抗体较急性期血清抗体水平呈4倍以上升高，证实为MERS-CoV阳性病例。单份血清（恢复期血清）中东呼吸综合征冠状病毒抗体阳性，证实有感染。人群血清学检测：感染率调查；确定危险人群。试剂需要向相关实验室索要。,四、解除隔离,体温基本正常、临床症状好转，病原学检测连续两次阴性，可出院或转至其他相应科室治疗其他疾病。,五、总结,MERS-CoV是个新型病毒。实验室标本最好使用下呼吸道标本。多位点，多次数采样。使用rRT-PCR法检测upE和ORF 1a两种靶目标阳性者，为MERS-CoV确诊阳性。不符合者，测序。双份血清学可以诊断MERS-CoV。单份血清，可以诊断是否感染。,谢谢！,
