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1、Northern Blot,湖南师范大学生命科学学院刘如石 博士/副教授,一、实验目的：1、掌握Northern blot的实验原理与操作技 术；2、了解Northern blot的实验在分子生物学 与转基因领域的应用。,二、实验原理：在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，然后将分离的RNA转移到尼龙膜，然后用放射性标记的探针进行杂交检测，最后进行放射性自显影。用途：检测样品中是否含有基因的转录产物（mRNA）及其含量。,三、实验材料,1、仪器 恒温水浴箱，电泳仪，凝胶成像系统，真空转移仪，真空泵，UV 交联仪，杂交炉，恒温摇床，脱色摇床，漩涡振荡器，分光光度计，微量移液器，电炉（
2、或微波炉），离心管，烧杯，量筒，三角瓶等。2、材料总RNA样品或mRNA样品，探针模板DNA(25 ng)，尼龙膜,3、试剂NorthernMax Kit（Cat.#1940，Ambion,Inc.），琼脂糖，DEPC,X光底片，底片暗盒，Random Primer，dNTP Mixture，111 TBq/mmol a-32P dCTP，Exo-free Klenow Fragment和10 X Buffer,Sephadex G-50,SDS，双氧水,灭菌水等。,四、实验步骤,1.用具的准备：180度烤三角锥瓶、量筒、镊子、刀片等4h；清洗梳子和电泳槽，并用双氧水浸泡过夜，用DEPC(di
3、ethypyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)水冲洗，干燥备用；处理DEPC水(2 L)备用2RNAZaP去除用具表面的RNase污染，用RNAZap擦洗梳子、电泳槽、刀片等，然后用DEPC水冲洗二次，去除RNAZap。3制胶：称取0.36mg 琼脂糖加入三角锥瓶中，加入32.4mlDEPC水后，微波炉加热至琼脂糖完全熔解。60空气浴平衡溶液(需加DEPC水补充蒸发的水分),加入3.6ml 10Denaturing Gel buffer，轻轻振荡混匀。注意尽量避免产生气泡。将熔胶倒入制胶板中，插上梳子。注：胶的厚度不能超过0.5cm。胶在室温下完全凝固后，将胶转移到电泳槽中，加入1 MOP
4、S Gel Running buffer盖过胶面约1cm。检查点样孔。,4.RNA样品的制备：在RNA样品中加入 3 倍体积的formaldehyde load dye和适当的EB。混匀后，65 15 min。短暂低速离心后，立即放置于冰上 5 min。5.电泳：将RNA样品小心加到点样孔中，5V/cm下进行电泳（在电泳过程中，每隔30 min 短暂停止电泳，取出胶，混匀两极的电泳液后继续电泳），当胶中的溴纷蓝接近胶的边缘时终止电泳；紫外灯下，检验电泳情况，并用尺子测量18S、28S、溴纷蓝到点样孔的距离（注意不要让胶在紫外灯下曝光太长时间）。,6.转膜：用3%双氧水浸泡真空转移仪，用RNAZ
5、ap擦洗多孔渗水屏和塑胶屏，用DEPC水冲洗二次。连接真空泵和真空转移仪，剪取一块适当大小的膜，在Transfer buffer 浸湿 5 min后，放置在多孔渗水屏的适当位置。盖上塑胶屏，盖上外框，扣上锁，将胶的多余部分切除，切后的胶四边缘要能盖过塑胶屏孔，并至少盖过边缘约2mm，以防止漏气。将胶小心放置在膜上，膜与胶间不能有气泡。,7打开真空泵，使压强维持在5058 mbar；立即将transfer buffer加到胶面和四周。每隔10 min在胶上加1 ml transfer buffer，转移2h。8转膜后将膜于1 MOPS Gel Running buffer 中轻轻泡洗10 sec
6、（去残余胶和盐）。9用吸水纸吸取膜上多余的液体后，将膜置于UV交联仪中自动交联。10将胶和紫外交联后的膜，在紫外灯下检测转移效率。(避免太长的紫外曝光时间)。11将膜在-20保存。,12.探针的制备：在1.5ml离心管中配制以下反应液：模板DNA(25 ng)1l；Random Primer 2 l；灭菌水 11 l；总体积：14 l。95 加热3 min后，迅速放置于冰冷却5 min。在离心管中按下列顺序加入以下溶液：10Buffer 2.5 l dNTP Mixture 2.5 l 111 TBq/mmola-32PdCTP 5 l Exo-free Klenow Fragment 1 l
7、 混匀后（25ul），37 下反应30 min。短暂离心，收集溶液到管底。65 加热5 min 使酶失活。,13.探针的纯化及比活性测定：准备凝胶：将1g 凝胶加入30 ml DEPC水中，浸泡过夜。用DEPC水洗涤膨胀的凝胶数次，以除去可溶解的葡聚糖。换用新配的TE(pH 7.6)。取1 ml 的注射器，去除内芯推扞，将注射器底部用硅化的玻璃纤维塞住，在注射器中装填12Sephadex G-50。将注射器放入一支15ml离心管中，注射器把手架在离心管口上。1600 g 离心 4 min，凝胶压紧后，补加 Sephadex G-50凝胶悬液，重复此步直至凝胶柱高度达注射器 0.9 ml 刻度处
8、。,100 l STE缓冲液洗柱，1600 g 离心4 min。重复3次。倒掉离心管中的溶液后，将一去盖的1.5ml离心管置于15 ml管中，再将装填了Sephadex G-50凝胶的注射器插入离心管中，注射器口对准1.5ml离心管。将标记的DNA样品加入25 l STE，取出0.5 l点样于 DE8-paper上，其余上样于层析柱上。1600 g 离心 4 min，DNA将流出被收集在去盖的离心管中，而未掺入DNA的 dNTP 则保留在层析柱中。取0.5 l己纯化的探针点样于DE8-paper 测比活性(试剂比活要求:106cpm/ml）。,14预杂交：将预杂交液在杂交炉中68预热，并漩涡使
9、 未溶解的物质溶解。加入适量的ULRAhyb到杂交管中(100 cm2加 入10ml ULRAhyb杂交液)，42预杂交4 h。15探针变性：用10 mM EDTA将探针稀释10倍。90热处理稀释后探针10 min，立即放置于 冰上5 min。短暂离心，将溶液收集到管底。,16杂交：加入0.5 ml ULTRAhyb到变性的探针中，混匀 后，将探针加到预杂交液中。42杂交过夜（1424 h），杂交完后，将杂交液收集起来于20保存。17洗膜：加入High Stringency Wash Solution 2(100cm2膜面积加入20 ml洗膜溶液)，42 摇动洗膜20 min两次。,18曝光：将膜从洗膜液中取出，用保鲜膜包住，以防止膜干燥；检查膜上放射性强度，估计曝光时间，将X光底片覆盖与膜上，曝光后 冲洗X光底片，扫描记录结果。19去除膜上的探针：将200 ml0.1%SDS（DEPC水配制）煮沸后，将膜放入，室温下让SDS 冷却到室温，取出膜，去除多余的液体，干燥后，可以保存几个月。20杂交结果,五、结果与分析：,THANK YOU!,
