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1、,临床PCR实验室生物安全,克州人民医院 高峰,outline,总论,凡是为预防、诊断、治疗任何人类疾病或损伤、或者评价人类健康而对人体的物质进行生物、微生物、血清化学、血液、生物物理、细胞或者其他类型检验的部门，统称为临床实验室,实验室每天要处理来自临床的标本，如血液、穿刺液、分泌物等，对这些“未知疾病标本”无法得知其危险程度，因此，每个临床实验室每天都面临生物安全隐患,真菌,病毒,细菌,临床实验室危害源,寄生虫,易燃性、腐蚀性、有毒性、强酸性化学品等,电器设备、辐射、噪声等,生物源危害,来源：临床实验室中处理的病人标本（细菌、病毒、真菌、寄生虫）,细菌（bacteria）,结核杆菌 Myc
2、obacterium tuberculosis.Rod-shaped Bacterium,白喉杆菌 Corynebacterium diphtheriae.Rod,clubed-shaped Bacterium(causes diphtheria),病毒（viruses）,狂犬病病毒 Rabies,DNA肿瘤病毒 DNA tumor viruses,脊髓灰质炎病毒 polio,Harrington和Shannon在1976年的调查中发现，结核分枝杆菌、乙型肝炎病毒与志贺菌已成为英国临床实验室工作人员最为常见的职业性感染原因,临床实验室生物污染的原因及种类,空气污染水的污染人体污染物体表面的污染
3、,空气污染,内：平面布局、气流方向 合理 死角区域 缩小外：直接外排或扩散 高效过滤 密闭或压力差,水、人体、物体表面污染,实验过程中产生的大量污水 特殊处理后排放工作人员实验室感染（接触、吸入）专门防护规程物体表面污染（溅出、溢出、穿用错误等）正确操作,化学源危害,含义：临床实验室内的部分化学品具有易燃、可燃、刺激、腐蚀性或剧毒性等危害,物理源危害,来源：噪音 辐射紫外线电磁场其他,实验室工作人员在实验过程中受到实验室生物污染而发生的感染,实验室感染,东北农大师生因动物实验感染严重传染病,2010年12月，东北农业大学30名学生在实验室进行“羊活体解剖学实验”，因实验动物购买未按黑龙江省实验
4、动物管理条例，未要求养殖场出具有关检疫合格证明，使28人被感染布鲁氏菌病 布病结核,2003年9月9日，新加坡一名患者被确诊感染了非典病毒。这名27岁的男子是新加坡国立大学专门研究西尼罗病毒的微生物实验室的一名研究生。由11名专家组成的国际调查小组认为，不恰当的实验程序、以及西尼罗病毒样本与非典冠状病毒在实验室里的交叉感染，可能是这名患者感染非典病毒的原因,新加坡的实验室SARS感染事件,实验室感染的途径,空气传播：接种环、吸管、注射器使用时经口传播直接接种：针刺、划伤等黏膜接触：如HIV能通过眼结膜进入人体节肢动物媒介（叮咬等）,消化道摄入传播,实验室感染的发生率(Britain)志贺菌临床
5、实验室感染 0.322 沙门菌临床实验室感染 0.137其他肠道致病菌如弧菌属细菌、弯曲菌属细菌及大肠埃希菌等的实验室感染率极低,职业HIV感染,Occupationally acquired AIDS cases or HIV infections reported ti CDC through 1992 Occupation No.(%)of occupational transmissions Laboratory technician 25(24.8)Nurse 26(25.7)Physician 13(12.8)Medical technician/paramedic 7(6.9)D
6、entist/dental technician 6(5.9)Health aide/attendant 6(5.9)Housekeeper/maintenance worker 6(5.9)Morgue technician 3(3.0)Technician/therapist 3(3.0)Respiratory therapist 2(2.0)Surgical technician 2(2.0)Other HCW 2(2.0)Total 101 Adapted from D.L.Sewell,Clinical microbiology reviews,1995,389-405,临床实验室安
7、全管理,硬件管理,实验室设备,个人防护设备,生物安全防护（biosafety containment）指在实验室环境下处理和保存感染性物质的过程中采用的一系列的防护措施，包括一级防防和二级防护,一级防护与二级防护,一级防护：包括规范操作技术与规程，配置适当的安全设备，保护操作人员和室内直接环境免遭感染性物质的污染二级防护：包括合理的实验室设施设计和严格规范的操作流程，用以保护实验室外环境免受感染性物质污染,个体防护装备,个体防护装备,装备 避免的危害 安全性特征实验服、隔离衣、连体衣 污染衣服 背面开口 罩在日常服装外鞋袜 碰撞和喷溅 不露脚趾护目镜 碰撞和喷溅 防碰撞镜片 侧面有护罩安全眼镜
8、 碰撞 防碰撞镜片 侧面有护罩面罩 碰撞和喷溅 罩住整个面部 发生意外时易于取下,个体防护装备,装备 避免的危害 安全性特征防毒面具 吸入气溶胶 在设计上包括一次性使用的、整 个面部或一半面部空气净化 的、整个面部或加罩的动力空 气净化的以及供气的防毒面具 手套 直接接触微生物 得到微生物学认可的一次性乳 划破 胶、乙烯树脂或聚腈类材料 保护手 网孔结构,生物安全柜,环境空气进入工作台过滤样本高效过滤排入室内或室外采用负压装置，形成气幕防护屏障，保护操作人员安全,实验室分区,清洁区：包括办公室、休息室、培养基室等半污染区：包括缓冲间、更衣室和卫生通道等污染区：包括样本收集区、处理区、培养区和废
9、弃物处理区等,实验室的出口和通道必须保持畅通无阻，不准堆放物品、垃圾、装置或设备,出口通路,BSL-2级实验室生物安全,二级生物安全防护实验室安全操作规程,1.禁止非工作人员进入实验室。参观实验室等特殊情况须经实验室负责人批准后方可进入。2.接触微生物或含有微生物的物品后，脱掉手套后和离开实验室前要洗手。3.禁止在工作区饮食、饮水、吸烟、处理隐形眼镜、化妆及储存食物。4.以移液器吸取液体，禁止口吸。,二级生物安全防护实验室安全操作规程,5.制定尖锐器具的安全操作规程。6.按照实验室安全规程操作，降低溅出和气溶胶的产生。7.每天至少消毒一次工作台面，活性物质溅出后要随时消毒。8.所有培养物、废弃
10、物在运出实验室之前必须进行灭活，如高压灭活。需运出实验室灭活的物品必须放在专用密闭容器内。9.制定有效的防鼠防虫措施。,二级生物安全防护实验室安全操作规程,10.实验室入口处须贴上生物危险标志,内部显著位置须贴上有关的生物危险信息,包括使用传染性材料的名称,负责人姓名和电话号码。11.进行感染性实验时，禁止他人进入实验室，或必须经实验室负责人同意后方可进入。免疫耐受或正在使用免疫抑制剂的工作人员必须经实验室负责人同意方可在实验室或动物房内工作。,二级生物安全防护实验室安全操作规程,12.实验室入口处须贴上生物危险标志，注明危险因子、生物安全级别、需要的免疫、负责人姓名和电话、进入实验室的特殊要
11、求及离开实验室的程序。13.工作人员应接受必要的免疫接种和检测(如乙型肝炎疫苗、卡介苗等)。14.并根据需要定期收集血清样本，应有检测报告，如有问题及时处理。,二级生物安全防护实验室安全操作规程,15.将生物安全程序纳入标准操作规范或生物安全手册，由实验室负责人专门保管，工作人员在进入实验室之前要阅读规范并按照规范要求操作。16.工作人员要接受有关的潜在危险知识的培训，掌握预防暴露以及暴露后的处理程序。每年要接受一次最新的培训。17.严格遵守下列规定，防止利器损伤：,二级生物安全防护实验室安全操作规程,17.1 除特殊情况(肠道外注射和静脉切开等)外，禁止在实验室使用针、注射器及其他利器。尽可
12、能使用塑料器材代替玻璃器材。17.2 尽可能应用一次性注射器，用过的针头禁止折弯、剪断、折断、重新盖帽、从注射器取下，禁止用手直接操作。用过的针头必须直接放人防穿透的容器中。非一次性利器必须放入厚壁容器中并运送到特定区域消毒，最好进行高压消毒。17.3 尽可能使用无针注射器和其他安全装置。17.4 禁止用手处理破碎的玻璃器具。装有污染针、利器及破碎玻璃的容器在丢弃之前必须消毒。,二级生物安全防护实验室安全操作规程,18.培养基、组织、体液及其他具有潜在危险性的废弃物须放在防漏的容器中储存、运输及消毒灭菌。19.实验设备在运出修理或维护前必须进行消毒。20.人员暴露于感染性物质时，及时向实验室负
13、责人汇报，并记录事故经过和处理方案21.禁止将无关动物带入实验室。,PCR实验室的生物安全,PCR技术的基本原理与PCR技术的特点,聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR),又称无细胞分子克隆系统或体外酶促基因扩增法。PCR技术是由穆利斯（Kary B Mullis）于1985年联合创造的。该技术可将极微量的靶DNA特异地扩增上百万倍，从而大大提高对DNA分子的分析和检测能力，能检测单分子DNA或对每10万个细胞中仅含1个靶DNA分子的样品。,PCR技术的基本原理,其原理类似于DNA的天然复制过程，PCR由变性退火延伸三个基本反应步骤构成。模板DNA的变性模
14、板DNA经加热至93左右一段时间后，模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备；模板DNA与引物的退火(复性)模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；,PCR技术的基本原理,引物的延伸DNA模板引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性退火延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”,这种新链又可成为下次循环的模板，每完成一个循环需24分钟，23个小时就能将待扩目标基因扩增放
15、大几百万倍。,PCR反应特点,特异性强：PCR反应的特异性决定因素为：引物与模板DNA特异正确的结合；碱基配对原则；Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性；靶基因的特异性与保守性。其中引物与模板的正确结合是关键。引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。灵敏度高：PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10-12)量级的起始待测模板扩增到微克(ug=-6)水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在细菌学中最小检出率为3个细菌。,PCR反应特点,简便、快速：PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应
16、，一般在24 小时完成扩增反应。一般采用实时荧光法进行分析，无放射性污染、易推广。对标本的纯度要求低：不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及总RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测。,PCR实验室基本概况,临床基因扩增检验实验室原则上分为四个分隔开的工作区域：1.试剂贮存和准备区2.标本制备区3.扩增反应混合物配制和扩增区4.扩增产物分析区如使用全自动分析仪，区域可适当合并。,各个分区的生物安全规范,各工作区域有明确的标记，不同工作区域内的设备、物品禁止混用。进入各工作区域必须严格按照单一方向进行，即试剂贮存和准备区标
17、本制备区扩增反应混合物配制和扩增区扩增产物分析区。不同的工作区域使用不同的工作服（例如不同的颜色）。工作人员离开各工作区域时，不得将工作服带出。,各个分区的生物安全规范,具体包括以下物品各分区不可混用1.微量加样器（覆盖l1000ul）2.移动紫外灯（近工作台面）3.消耗品：一次性手套、耐高压处理的离心管和加样器吸头（带滤心）4.专用工作服和工作鞋5.专用办公用品等,（一）试剂贮存和准备区,贮存试剂和用于标本制备的材料应直接运送至试剂贮存和准备区，不能经过产物分析区。在打开含有反应混合液的离心管或试管前，应将其快速离心数秒。试剂原材料必须贮存在本区内，并在本区内制备成所需的贮存试剂。当贮存试剂
18、溶液经检查可用后，应将其分装贮存备用，避免由于经常打开反应管吸液而造成污染。,在整个区的实验操作过程中，操作者必须戴手套，并经常更换。此外，操作中使用一次性帽子也是一个有效地防止污染的措施。严禁用嘴吸取液体，加样器和吸头等必须经高压处理。工作结束后必须立即对工作区进行清洁。本工作区的实验台表面应可耐受诸如次氯酸钠的化学物质的消毒清洁作用。实验台表面的紫外照射应方便有效。由于紫外照射的距离和能量对去污染的效果非常关键，因此可使用可移动紫外灯（254nm波长），在工作完成后调至实验台上6090cm内照射。由于扩增产物仅几百bp，对紫外线损伤不敏感，因此紫外照射扩增片段必须延长照射时间，最好是照射过
19、夜。实验室及其设备的使用必须有日常记录。,（二）标本制备区,要正确使用加样器。由于在加样操作中可能会发生气溶胶所致的污染，所以应避免在本区内不必要的走动。可通过在本区内设立正压条件避免从邻近区进人本区的气溶胶污染。为避免样本间的交叉污染，加人待测核酸后，必须盖好含反应混合液的反应管。对具有潜在传染危险性的材料，必须有明确的样本处理和灭活程序。用过的加样器吸头必须放人专门的消毒（例如含次氯酸钠溶液）容器内。实验室桌椅表面每次工作后都要清洁，实验材料（原始血标本、血清标本、提取中的标本与试剂的混合液等）如出现外溅，则必须分别处理并作出记录。,对实验台适当的紫外照射（254nm波长，与工作台面近距离
20、）适合于灭活去污染。可移动紫外线管灯可用来确保工作后对实验台面的充分照射。样本处理对核酸扩增有很大影响，必须使用有效的核酸提取方法，可在开展临床标本检测前对提取方法进行评价。,（三）扩增区,已制备的DNA模板和合成的cDNA（来自样本制备区）的加人和主反应混合液（来自试剂贮存和制备区）制备成反应混合液等也可在本区内进行。在巢式PCR测定中，通常在第一轮扩增后必须打开反应管，因此巢式扩增有较高的污染危险性，第二次加样必须在本区内进行。不能从本区再进人任何“上游”区域，可降低本区的气压以避免气溶胶从本区漏出。,为避免气溶胶所致的污染，应尽量减少在本区内的走动。如有加样则应在超净台内进行。打开预处理
21、过的反应混合液时必须防止液体溅出，尤其是在巢式扩增步骤之间。一个简单的方法是在打开反应管前快速离心数秒。可使用体积较小的离心机，因其所占实验台面小，易于用一只手操作，适合于大多数超净台。防潮屏障如石蜡油或轻矿物油也具有防污染作用，但必须注意的是，矿物油本身也可能成为一种持续性的污染源。用过的加样器必须注意清洁消毒。完成操作及每天工作后都必须对实验室台面进行清洁和消毒，紫外照射方法与前面区域相同。如有溶液溅出，必须处理井作出记录。,（四）扩增产物分析区,本区是最主要的扩增产物污染来源，因此必须注意避免通过本区的物品及工作服将扩增产物带出。在使用PCRELISA方法检测扩增产物时，必须使用洗板机洗
22、板，废液必须收集至 lmolL HCI中，并且不能在实验室内倾倒，而应至远离 PCR实验室的地方弃掉。用过的吸头也必须放工 lmolL HCI中浸泡后再放到垃圾袋中按程序处理，如焚烧。,由于本区有可能会用到某些可致基因突变和有毒物质如澳化乙锭、丙烯酸胺、甲醛或同位素等，故应注意实验人员的安全防护。本区的清洁消毒和紫外照射方法同前面区域。本区如采用负压条件或减压情况下（如安装排风扇）可减少扩增产物从本区扩散至前面区域的可能性,实验室污染,这是最常见的污染源，由于PCR技术可以在几个小时内将模板中某些特异性序列扩增到数百万倍以上，扩增产物可能在电泳等过程中污染移液器、操作台或随着蒸发所形成气溶胶而
23、污染整个实验室。扩增产物又是最有效的模板，一旦出现产物污染其污染程度都较严重。,实验室污染,判断方法：可以将实验中最关键步骤如试剂分装、样品处理等转移到一个新的环境中或转移到超净工作台中完成。当然，所用移液器、吸咀管（离心管）都应彻底更换。,实验室污染,解决方法：实验室污染是PCR扩增过程中最易出现的现象，而且一旦出现污染，消除污染源又极其困难，往往需对整个实验室及实验器材彻底清洗处理，所以应该以预防为主，实验过程中严格遵守实验基本要求，样品处理与扩增产物及电泳应尽量分开，最好能在两个房间进行。扩增前处理所用的移液器及扩增后点样用的移液器应严格地分开，不可互换。PCR室应保持良好的通风、清洁、
24、最好能专用。,在实验室中引起火灾的通常原因,1、超负荷用电2、电器保养不良，例如电缆的绝缘层破旧或损坏3、供气管或电线过长4、仪器设备在不使用时未关闭电源5、使用不是专为实验室环境设计的仪器设备6、明火7、供气管老化锈蚀8、易燃、易爆品处理、保存不当9、不相容化学品没有正确隔离10、在易燃物品和蒸气附近有能产生火花的设备11、通风系统不当或不充分,防火,隐患的估计和研究易燃易爆物火源隐患（电、火、气、试剂）,现场配备：灭火设备 报警装置 疏散路径 通道标识,1.加热 安全使用酒精灯2.明火 实验室内严禁吸烟 在使用易燃气体和易燃试剂的实验室内不得使用明火,灭火,学会使用灭火器（一拔、二握、三瞄
25、、四扫）易燃固体、易燃气体、易燃液体和带电物体着火时，可用干粉灭火器灭火,灭火器基本知识,导线或电器着火时，应先断电，再用干粉灭火器灭火衣服着火时，应尽快地脱掉衣服，并用水灭火。或就地滚动，切忌外跑,实验室灭火推荐选用CO2灭火器,化学危险物品使用安全准则,所有化学危险品的容器都应有清晰标记，实验室管理人员有责任向工作人员介绍化学危险物品，应有材料安全数据表显示每一种化学危险物品的特性,2010年9月9日，香港科技大学一间实验室9日发生有毒化学品泄漏事件，一名职员打开实验室内储存柜时，发现柜内一樽一公升已稀释丙烯醛出现液体泄漏及冒出浓烈刺鼻气味，职员吸入气体不适送院治疗,气体,直立放置时要稳妥；气瓶要远离热源；避免曝晒和强烈振动 一般实验室内存放气瓶量不得超过两瓶氢气瓶和氧气瓶不能同存一处,谢谢！,
