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1、第八章：PCR技术及应用,PCR技术是模拟体内DNA复制的的方式，在体外选择性的将DNA某个特殊区域扩增出来的技术。其过程与普通DNA复制一样有三个步骤，首先是模板DNA变性，由双链状态变成单链状态;然后引物与模板结合，完成复制过程；最后在DNA聚合酶和底物存在情况下合成与模板互补的DNA。,第一节 PCR技术原理和工作方式,一、PCR的基本原理1、基本要素和扩增原理DNA的复制是生命活动中最基本的过程之一，PCR的基本原理离不开DNA复制的基本规律。在PCR过程中模板可以是双链DNA也可是单链DNA，最后扩增出来的是双链状态的。其中引物是DNA复制中不可缺少的。,与单纯的DNA复制不同的是，
2、PCR扩增总是在两个引物的存在下对DNA的两条链同时进行复制，复制的结果得到一条双链DNA。通过仪器的自动控制，使这样的DNA复制重复进行，从而得到大量的位于两个引物之间的DNA片段，即目的片段。前一轮扩增得到的DNA产物可做下一轮扩增的模板，扩增产物以几何级别递增。,2、PCR扩增的步骤 首先将模板DNA置于9296度进行变性处理，使双链DNA在高温下解链成为单链DNA此时的温度称为解链温度Tm，且热变性不改变其化学性质；染后退火，将温度降至3772度，使引物与模板的互补区结合，最后在72度条件下，DNA聚合酶将dNTP连续加到引物的3羟基端合成DNA这个步骤称为延伸。这三个热反应过程的重复
3、性称为一个循环经过2040个循环可扩增得到大量位于两条引物序列之间的DNA片段。,Tm(melting temperature)：50%DNA分子变性时温度称为熔解温度/解链温度。一般生理条件下，Tm在85-95之间。影响Tm值的因素：（G+C）含量增加，Tm值增高 溶液的离子强度高，则Tm增加（离子键的形成增多）；甲酰胺的浓度增加，则Tm下降（使碱基对间的氢键不稳定，可避免G、C含量高的DNA在高温变性时引起断裂而失活）；若DNA组成比较单一，则变性发生在狭窄的温度范围内.,二、PCR反应体系,PCR反应需要在一定的条件下才能完成，只有这些条件协调作用时才能达到很好的效果。1、缓冲液2、脱氧
4、三磷酸核苷（dNTP）3、引物4、模板5、DNA聚合酶,1、缓冲液：缓冲液除了提供pH缓冲能力外，还有一些辅助反应进行的成分，主要是Mg2+。Mg2+浓度的高低会影响扩增的特异性和产率，直接影响扩增的成败，最佳的镁离子浓度对于不同的引物对和模板都不同。为了确定最佳浓度,可以用0.1-5mmol/L的递增浓度的Mg2+进行预备实验,选出最适的Mg2+浓度。2、脱氧三磷酸核苷（dNTP）脱氧三磷酸核苷是DNA合成的底物，高浓度dNTP易产生错误掺入；但浓度过低，将降低反应产物的产量。四种脱氧三磷酸核苷酸的浓度应相同，如果其中任何一种的浓度明显不同于其它几种时（偏高或偏低），就会诱发聚合酶的错误掺入
5、作用，降低合成速度，过早终止延伸反应。PCR中常用终浓度为200M的dNTP,3、模板 模板是将要被复制的核酸片段DNA或RNA，因此模板是PCR 的关键，模板的质量是PCR 成功的先决条件，一般要有较高的纯度，最好用纯化的DNA样品，（粗品应避免混有蛋白酶、核酸酶）。另外模板的数量也会直接影响扩增的效果，一般要求含量合适，3105分子数（1g）（提高产量，减少非特异性扩增）；4、DNA聚合酶 PCR反应中使用的DNA聚合酶是耐高温的，在90度以上的高温下仍能有活性。也正是高温DNA聚合酶的应用才使得PCR技术得以推广。选择聚合酶要从实验的具体要求考虑，高保真的酶成本较高，只有要求严格时选用。
6、,Taq DNA聚合酶被看做是低保真度的聚合酶，因为其缺少3到5外切核酸酶（校正）活性，但是产量高，是目前实验室应用最多的酶。使用带有3到5外切核酸酶活性的热稳定聚合酶可以提高保真度。但是这些聚合酶的产量比Taq DNA聚合酶低。(1)Taq DNA聚合酶是目前实验室PCR中应用最多的酶。具有5到3合成活性和5到3外切酶活性，但无3到5外切酶活性。在95度的半衰期为40分钟。由于没有3到5外切酶活性，在扩增中有8.910-51.110-4的错配率。,（2）TthDNA聚合酶来自嗜热热细菌HB8在74度下进行扩增Mg+存在条件下，以DNA为模板合成DNA，Mncl2存在下可以RNA为模板合成cD
7、NA。（3）VentDNA聚合酶（4）pwoDNA聚合酶 是使用较多具有3到5外切酶活性且具有高保真度的PCR酶（5）pfuDNA聚合酶 是目前使用最广范具有3到5外切酶活性的PCR酶商用混合酶,学习本节课我们应该掌握以下问题,1.简述PCR反应的工作原理。是在模板DNA、引物和dNTP的存在下依赖于DNA聚合酶的酶促反应。由一对引物介导,通过温度的调节，使双链DNA变性为单链DNA、单链DNA能与引物复性（退火）成为引物-DNA单链复合物、在dNTP存在下,DNA聚合酶能使引物沿单链模板延伸成为双链DNA（引物的延伸）；这种热变性-复性-延伸的过程，就是一个PCR循环；,2.循环次数是否越多
8、越好？为何？很明显不是的，任何事都要有一个度。一般循环在25到30次之间尔后循环数的进一步增加并不意味着产物的数量一定增加这是由于PCR扩增过程中后期会出现平台效应，这时期产物的积累按减弱的指数速率增长这时一些不利因素也会产生：如底物和引物浓度降低、dNTP和DNA聚合酶的稳定性或活性降低、产生的焦磷酸会产生末端产物抑制作用、非特异性产物或引物的二聚体会产生非特异性竞争、扩增产物的自身复性、高浓度扩增产物变性不彻底,3.进行PCR引物设计时应注意哪些原则?(1)长度：16-30bp，一对引物。过短-非特异性扩增增加，竟争并抑制特异扩增，从而降低扩增的灵敏性；过长-易形成稳定的杂合体或链内互补，
9、使引物的延伸温度超过Taq酶的最适温度，同时还使检测成本增加。(2)G+C含量：占40-60%，Tm值在55 以上。GC含量太低导致引物Tm值较低，使用较低的退火温度不利于提高PCR的特异性；GC含量太高也易于引发非特异扩增。,(3)碱基的随机分布：引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。3末端最佳选择为G 和C；但不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。但现在的观点认为，在3端尽可能选用T，少用G或C，这样可更好的避免假引发。（错配率：T G或C A）(4)引物自身及引物之间不应存在互补序列 引物自身和引物之间不能有连续3个碱基的互补。引物自身存在互补序列，会使引物自身折叠成发夹结构，使引物本身复性，这种二级结构会影响引物与模板的复性结合。两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3端的互补重叠以防止引物二聚体的形成。,(5)引物的5端可以修饰，而3端不可修饰：引物的5端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5端修饰包括：添加酶切位点；生物素、地高辛、荧光等标记；引入蛋白质结合DNA序列；引入启动子序列等。引物的延伸是从3端开始的，不能进行任何修饰。,
