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1、实验三：PCR扩增检测乙肝病毒,乙肝病毒（HBV）感染引起的乙型肝炎，我国发病率很高，HBV的检测极其重要。HBV DNA存在就可以引起乙肝的传染，乙肝病毒基因是乙肝病毒的核心成分，是病毒复制的发动机。,PCR技术可以检测出极微量的病毒，是判断其传染性最直接、最可靠的证据。PCR技术已成为公认的对病毒性肝炎的诊断、疗效观察及预防研究工作最理想的方法之一。,一、实验目的1.掌握PCR技术扩增的原理2.熟悉PCR扩增检测乙肝病毒的基本操作过程。,二、实验原理 聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction)简称PCR,是在体外条件下利用DNA聚合酶、催化一对引物间的特异性DNA片
2、段合成的基因体外扩增技术，它包括三个基本过程：,1.变性：加热使双链DNA变为单链2.退火：急速降温使引物和互补模板 在局部形成杂交链 3.延伸：耐热DNA聚合酶按5 3 方向催化以引物为起始点的 延伸反应,模板DNA,高温变性,低温退火,引物,适温延伸,经过25-35次循环后，目的片段扩增2n倍,两条子代DNA,一次循环,Tap酶,5,3,3,5,3,5,5,3,5,3,三、主要器材及试剂1.主要器材：,9700型PCR仪,电泳槽、电泳仪,紫外分析仪,台式高速离心机,2.主要试剂：,四、操作步骤1.标本处理：取患者血清40l，加入DNA提取液40l，沸水浴10分钟，10000转离心5分钟，取
3、上清液4l做PCR反应。,2.加样：加入提取好的标本4l，6000转离心10秒。,三个扩增步骤温度及时间,循环次数：25次,3.PCR仪上扩增：,PCR仪上扩增,加入标本,离心,6000转离心10秒,4.电泳检测：制备2%琼脂糖凝胶,2%琼脂糖的制备：,电泳槽的准备：,称取0.8g琼脂糖,40mlTBE电泳缓冲液（PH8.0)煮沸溶解,加入,冷却,60左右,加入溴乙啶EB20l,倒胶,加样：取扩增后的产物10 ul点样于凝胶孔,取样,点样,电泳：点样端接“-”，稳压，50V，电泳30分钟。五、结果观察：紫外分析仪下观察，出现橙黄色条带则为HBV阳性,HBV阳性,HBV阴性,HBV阳性对照,HBV阴性对照,正极,负极,点样孔,五、注意事项1.试剂盒内阳性标本及DNA提取液使用前需充分融化离心。2.反应液的表面为固体封盖剂，电泳取样时从反应管底部吸液。3.EB为强致癌物，操作过程应注意防护。4.注意无菌操作，以免出现假阳性。,Thank you!,
