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1、第二章 PCR技术的原理及应用,故事发生在1983年的春夏之交,Kary B.Mullis(1944-)，在Cetus公司工作期间，发明了PCR。他原本是要合成DNA引物来进行测序工作，却常为没有足够多的模板DNA而烦恼。1983年春夏之交的一个晚上，他开车去乡下别墅的路上萌发了用两个引物（而不是一个引物）去扩增模板DNA 的想法.,很少有在公司工作的科研人员得诺贝尔奖，Mullis是其中之一,Mullis开车的时候,瞬间感觉两排路灯就是DNA的两条链，自己的车和对面开来的车象是DNA聚合酶，面对面地合成着DNA，,Mullis的第一个PCR实验,1983年9月中旬。Mullis在反应体系中加
2、 入DNA聚合酶后在37 一直保温。结果第二 天在琼脂糖电泳上没有 看到任何条带。于是他认识到有必要用加热来解链，每次解链后再加入DNA聚合酶进行反应，依次循环。1983年12月，他终于看到了被同位素标记的PCR条带。,第一种高温菌DNA聚合酶的分离,美国黄石国家公园,Thermus aquaticus,The Thermusaquaticus DNApolymeraseTaqNot permanentlydestroyed at 94COptimaltemperature is 72C,耐高温DNA聚合酶的种类,Taq DNA聚合酶(Thermus aquaticus，Cetus/Roche
3、)Tth DNA聚合酶(Thermus thermophilus，Toyobo)Pfu DNA聚合酶（Pyrococcus furiosus，Stratagene）Deep Vent DNA聚合酶(Bio-labs）Tfl DNA聚合酶（Thermus flavus，Promega)Tli DNA聚合酶(Thermococcus litoralis，Promega)Vent DNA聚合酶(Bio-labs）Pwo DNA聚合酶(Pyrococcus woesei，Roche)Pfx DNA聚合酶(Thermococcus kodakaraensis,Invitrogen)Dynazyme DN
4、A聚合酶（Thermus brockianus，Finnazyme）FD DNA聚合酶(Thermus sterophilus？，复旦大学)Tma,Tne,KOD,PCR仪器的变迁,三个水浴锅，用手移动（Mullis等人当时用的）电加热块 自来水冷却（PE，1988）电加热块 内置循环液冷却（PE，1989）三个加热块 机械手（Stratagene，1994）半导体制冷和加热（MJ,PE,BioMetra,Eppendrof）温度梯度,荧光检测(如 Roche的Lightcycler)风加热Lab-on-chip式的PCR仪(所谓的芯片PCR)中国的状况1991年出现三个水浴锅+机械手的原始P
5、CR仪（华美，复日等）现在以半导体（Peltier板）制冷式为主（杭州博日,上海天呈,厦门安普利等）,PCR的发展史,1983年春，Mullis发展出PCR的概念；1983年9月，Mullis用大肠杆菌DNA聚合酶做了第一个PCR实验，只用一个循环；1983年12月，用同位素标记法看到了10个循环后的49 bp长度的第一个PCR片断；1985年12月20日，Mullis的同事Saiki在Science上发了一篇论文，方法中用了PCR技术，导致Mullis的文章到处被拒；1985年10月25日申请了PCR的专利，1987年7月28日批准（专利号4,683,202），这回Mullis是第一发明人。
6、1986年5月，Mullis在冷泉港实验室做专题报告，全世界从此开始学习PCR的方法；1986年6月，Cetus公司纯化了第一种高温菌DNA聚合酶，Taq DNA polymerase，这是85年春天Mullis建议做的；1988年，第一台PCR仪问世；1991年，Hoffman LaRoche以3亿美元的代价从Cetus公司获得全权开发权。,PCR不只是一个方法改进,Mullis的上司有句“名言”，“我们要扩增这么多DNA样品有什么用”；到了1991，Cetus公司以3亿美元的转让费将PCR相关专利转让给瑞士Hoffman LaRoche公司，并在此后的经营中又获得了数亿美元的分红；Mull
7、is于1993年获得诺贝尔化学奖，PCR和DNA重组技术一样意义深远。,PCR相关的术语和产品层出不穷,T-vectorHotStart TaqRT-PCRRAPD-PCRDDRT-PCRLM-PCRInverse PCRNested PCRReal-time PCRRACEFlow chip PCR,TASMultiplex PCRImmuno PCRAsymmetric PCRLP-PCRNASBA Recombinant PCR AFLPSSCPIn situ PCRTaqMan/SYBR green,1st cycle,2nd cycle,3rd cycle,过 程,变 性,引 物 退
8、 火,DNA 复制,（一）PCR的基本原理,（二）PCR的种类1.普通PCR,PCR,琼脂糖凝胶电泳,最终产物,紫外光观察,3-4 小时,PCR具有极高的灵敏度,样品,正对照,负对照,标准分子量,污染是PCR实验的常见问题。只要实验室里曾经扩增过某个片段，就有可能以后的实验中发生污染。,因此，做实验的时候绝对不要忘了负对照。用紫外灯破坏污染物也是一个办法,（二）PCR的种类2.RT-PCR：反转录PCR(reverse transcriptase-PCR)原理：RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA，再以cDNA为模板
9、，扩增合成目的片段。特点：作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。无论使用何种RNA，关键是确保RNA中无RNA酶和基因组DNA的污染。用于反转录的引物可视实验的具体情况选择随机引物、Oligo dT 及基因特异性引物(GSP)中的一种。对于短的不具有发卡结构的真核细胞mRNA，三种都可。应用：RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，分析基因的转录水平，细胞中RNA病毒的含量，直接克隆特定基因的cDNA序列。,两步法RT-PCR示意图,一步法RT-PCR示意图,一步法和两步法RT-PCR的比较,cDNA合成过程示意图,cDNA序列的克隆,（二）PCR的种类2.Nested P
10、CR：巢式PCR原理：利用两套PCR引物（巢式引物）对进行两轮PCR扩增反应。在第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产物，此产物在内引物的存在下进行第二轮扩增。优点：由于巢式PCR反应有两次PCR扩增，从而降低了扩增多个靶位点的可能性（因为与两套引物都互补的引物很少）增加了检测的敏感性；两对PCR引物与检测模板的配对，增加了检测的可靠性；增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的灵敏度，并且提高了困难PCR（如5RACE）的特异性。应用：一般应用于动物方面。如：病毒，梅毒螺旋体，HIV，肿瘤基因等。,Nested PCR原理示意图,（二）PCR的种类3.Inverse PCR：反向PCR原理：用适当的限
11、制性内切裂解含核心区的DNA，以产生适合于PCR扩增大小的片段，然后片段的末端再连接形成环状分子。PCR的引物同源于环上核心区的末端序列，但其方向可使链的延长经过环上的未知区而不是分开引物的核心区。这种反向PCR方法可用于扩增本来就在核心区旁边的序列，还可应用于制备未知序列探针或测定边侧区域本身的上、下游序列。优点：可使已知序列的核心区边侧的未知DNA成几何级数扩增。应用：一般应用于未知序列的扩增，有时也用于定点突变。,Inverse PCR原理示意图,（二）PCR的种类,4.PCR-RFLP:多聚酶链反应(PCR)-限制性片段长度多态性(restriction fragment length
12、 Polymorphism，RFLP)原理：PCR产物限制性内切酶切多态性分析，DNA发生重排后，酶切位点发生改变。优点：具有分辩率高，无需标记,重复性好，简便快速直观等。主要用于核酸变异性分析与比较,微生物的分群分型分亚型，癌基因分析，遗传病的诊断等。局限：只能应用突变引起限制性酶切位点改变的情况下，一次只能完成一个特定位点突变筛选，检测效率低。,PCR-RFLP原理示意图,5.PCR-SSCP：聚合酶链反应一单链构象多态性(single strand conformation polymorphism)原理：是将经扩增的DNA片段经过变性处理，形成单链，由于序列不同，单链构象就有差异，在中
13、性聚丙烯酰胺凝胶中电泳的迁移率不同，通过与标准物的对比，即可检测出有无变异。特点：刚建立时是将同位素掺入PCR扩增的产物中，通过放射自显影显示结果。后用银染取代同位素显示DNA带型，大大降低了成本，具有经济、快速、灵敏等特点。1993年起用EB染色法显示DNA带型。优点：检测基因变异，具有操作简便、快速、不需特殊设备，适用于大样本筛选。己广泛应用于检测各种病原体基因的点突变及缺失突变，基因的多态性分析等。,（一）PCR的种类,PCR-SSCP示意图,从定性到定量的革命,聚合酶链式反应(PCR)可对特定核苷酸片断进行指数级的扩增。在扩增反应结束之后，我们可以通过凝胶电泳的方法对扩增产物进行定性的
14、分析，也可以通过 放射性核素掺入标记后的光密度扫描来进行定量的分析。无论定性还是定量分析，分析的都是 PCR 终产物。但是在许多情况下，我们所感兴趣的是未经 PCR 信号放大之前的起始模板量。例如我们想知道某一转基因动植物转基因的拷贝数或者某一特定基因在特定组织中的表达量。在这种需求下荧光定量PCR技术应运而生。,普通PCR定量分析的困惑,PCR产物生成曲线,logDNA,Cycles,logDNA,Cycles,不同样品有不同的生成曲线,实时定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，使每一个循环变得“可见”，最后通过Ct值和标准曲线对样品中的
15、DNA(or cDNA)的起始浓度进行定量的方法。实时荧光定量PCR是目前确定样品中DNA(或cDNA)拷贝数最敏感、最准确的方法。,Real Time PCR and Conventional PCR,VS,Repeat,DenaturationPrimer AnnealingElongation,常规 PCR Process,In theory,product accumulation is proportional to 2n,where n is the number of amplification cycle repeats,Reality vs.Theory,Amplificat
16、ion is exponential,but the exponential increase is limited:,A linear increase follows exponentialEventually plateaus,定量的最佳时期,Quantitative information comes from monitoring the early stages of amplification.,Real Life,Detector,Theoretical,Log Target DNA,Cycle#,普通PCR和荧光定量PCR的区别,常规PCR是通过电泳对扩增反应的最终产物进行定
17、性分析（定量不准确），无法进行实时检测；荧光定量PCR是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，使每一个循环变得“可见”，通过Ct值和标准曲线对样品中的DNA(or cDNA)的起始浓度进行定量的方法（准确定量）。,普通PCR和定量PCR的区别,适用定性分析，不适合定量分析；PCR 产物的长度从100bp 数kb,实时检测:每个循环都产出荧光信号绝对定量，灵敏度更高 PCR产物的长度一般在 60-150 bps,荧光定量PCR的原理,基本原理：扩增呈指数增长，在反应体系和条件完全一致的情况下，样本DNA含量与扩增产物的对数成正比。由于反应体系中的荧光染料或荧光标
18、记物(荧光探针)与扩增产物结合发光，其荧光量与扩增产物量成正比。因此，通过荧光量的检测就可以测定样本核酸量。荧光化合物分为两类（1）非特异性的嵌入荧光染料：利用嵌入荧光染料检测，只是简单地反映PCR反应体系中总的核酸量，是一种非特异性的检测方法。（2）特异性荧光(引物)探针：增加了探针的识别步骤,特异性、专一性更高。,非特异性的嵌入荧光染料（Non-specific DNA binding dyes）,SYBR Green ISYBR GoldEthidium Bromide,Real-Time PCR，SYBR green,Molecular Probe公司的一个专利产品，US Patent
19、5,436,134 1993年7月12日申请,SYBR green 的优缺点,简便可以使用已有的引物普遍通用可以检测所有的双链DNA，包括引物二聚体；需要化大力气优化反应条件，以消除非特异性扩增；价格$1/PCR 反应定量的灵敏度有所欠缺,Extension,Extension ContinuedApply ExcitationWavelength,Repeat,DNA binding dyes,特异性的荧光探针,特异性的荧光探针是把荧光化合物标记到特异性的寡核苷酸上形成荧光标记的DNA探针。通过探针与PCR产物特异性的结合,在PCR过程中可对产物实现均相、实时、定量检测,也适用于多通道检测。
20、TaqMan探针,定量 PCR，TaqMan体系,ABI 公司首先推出(PRISM 7000系列)US Patent 5,723,591,1995年11月申请。实时检测:每个循环都会产生与PCR产物成正比的荧光物质,TaqMan探针是一段5端标记报告荧光基团(R),3端标记淬灭荧光基团(Q)的寡核苷酸,其序列与模板DNA中的一段完全互补。当探针单独存在时,由于荧光共振能量转移的发生,R的荧光受到Q的猝灭。在PCR过程中,由于TaqDNA酶的5-3外切酶活性的作用,使探针的5端的R被切断,加大了与Q的距离而使荧光恢复。一分子的产物生成就伴随着一分子的荧光信号的产生。随着扩增循环数的增加,释放出来
21、的荧光基团不断积累。因此,Taqman探针检测的是积累荧光。,Cleavage-based assay:TaqManTM,d.NTPs,Thermal Stable DNA Polymerase,Primers,Add Master Mix and Sample,Denaturation,Annealing,Reaction Tube,l,5,3,Extension Step,1.Strand Displacement,2.Cleavage,3.PolymerizationComplete,4.Detection,l,Cleavage-based assay:TaqManTM,Cycle,一般
22、而言，荧光扩增曲线扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段,荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，我们无法判断产物量的变化。而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加。PCR 的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的 PCR 产物量不能计算出起始 DNA 拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR 产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。为了定量和比较的方便，在实时荧光定量 PCR 技术中引入了两个非常重要的概念：荧光阈值和 CT 值。荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧
23、光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般我们将荧光域值的缺省设置是 3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的 10 倍。每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为 CT 值。,Ct value and Real-Time Quantitative PCR Theory,Ct值(Threshold Cycle)PCR扩增过程中，扩增产物荧光信号超过基线值（进入指数增长期）时的循环数。,principle of quantitative real-time PCR use when rather than how much,fluorescent signal,PCR cycles,re
24、al-time PCR amplification plots(7 x 10-fold dilns.+NTC),Threshold Cycle,CT,Correlates strongly with the starting copy number Is linear with the log of starting copy number,The least?,Which one has the most?,TaqMan系统的一个例子,10ng,0.001ng,Titrate a template;10,1,0.1,0.01,0.001 ng,模板起始浓度越高，Ct值越小 Ct值与模板起始拷
25、贝数的对数存在线性关系,Ct值与模板起始浓度的关系,如果模板浓度增加1倍，Ct值就提前1个循环到达 如果模板浓度减少1倍，Ct值就滞后1个循环到达,利用定量PCR进行SNP定型,杂合子,野生性纯合子,突变纯合子,Taqman的优缺点,单一荧光系统中不能在同一管中进行多片断扩增 不同的基因必须在不同的试管中管之间的精确度跟多荧光系统同等的精确和 可靠灵敏度高，定量方便费用高多种荧光提供仪器价格比较贵,定量PCR相关的近年来国际学术刊物上发表的论文数,1996,1997,1998,1999,2000,2003年已经达到3000篇,PCR的应用领域,生物学领域几乎无处不用,基因、DNA片段的克隆人工基因构建DNA序列测定基因定点突变基因型（突变）检测，SNP分析，遗传背景分析生物物种鉴定，系统进化研究基因表达量研究（real-time PCR）/基因表达谱研究（DNA chip,SAGE）,医学领域,疾病基因检测/遗传病的产前诊断致病病原体的检测 肿瘤治疗中癌基因的检测 会推广到大部分疾病治疗前的检测 DNA指纹、个体识别、亲子关系鉴别、法医物证 其他:动、植物检疫（转基因动植物检测）,
