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1、PCR的发明，应用现状及未来发展趋势,黄伟达，复旦大学生物化学系 2004年12月3日于杭州博日科技研讨会,DNA，生命的蓝图,故事发生在1983年的春夏之交,Kary B.Mullis(1944-)，在Cetus公司工作期间，发明了PCR。他原本是要合成DNA引物来进行测序工作，却常为没有足够多的模板DNA而烦恼。1983年春夏之交的一个晚上，他开车去乡下别墅的路上萌发了用两个引物（而不是一个引物）去扩增模板DNA 的想法.,很少有在公司工作的科研人员得诺贝尔奖，Mullis是其中之一,Mullis开车的时候,瞬间感觉两排路灯就是DNA的两条链，自己的车和对面开来的车象是DNA聚合酶，面对面
2、地合成着DNA，,Mullis的第一个PCR实验,1983年9月中旬。Mullis在反应体系中加 入DNA聚合酶后在37 一直保温。结果第二 天在琼脂糖电泳上没有 看到任何条带。于是他认识到有必要用加热来解链，每次解链后再加入DNA聚合酶进行反应，依次循环。1983年12月，他终于看到了被同位素标记的PCR条带。,PCR的发展史,1983年春，Mullis发展出PCR的概念；1983年9月，Mullis用大肠杆菌DNA聚合酶做了第一个PCR实验，只用一个循环；1983年12月，用同位素标记法看到了10个循环后的49 bp长度的第一个PCR片断；1985年12月20日，Mullis的同事Saik
3、i在Science上发了一篇论文，方法中用了PCR技术，导致Mullis的文章到处被拒；1985年10月25日申请了PCR的专利，1987年7月28日批准（专利号4,683,202），这回Mullis是第一发明人。1986年5月，Mullis在冷泉港实验室做专题报告，全世界从此开始学习PCR的方法；1986年6月，Cetus公司纯化了第一种高温菌DNA聚合酶，Taq DNA polymerase，这是85年春天Mullis建议做的；1988年，第一台PCR仪问世；1991年，Hoffman LaRoche以3亿美元的代价从Cetus公司获得全权开发权。,PCR不只是一个方法改进,Mullis的
4、上司有句“名言”，“我们要扩增这么多DNA样品有什么用”；到了1991，Cetus公司以3亿美元的转让费将PCR相关专利转让给瑞士Hoffman LaRoche公司，并在此后的经营中又获得了数亿美元的分红；Mullis于1993年获得诺贝尔化学奖，PCR和DNA重组技术一样意义深远。,PCR的应用领域,生物学领域几乎无处不用,基因、DNA片段的克隆人工基因构建DNA序列测定基因定点突变基因型（突变）检测，SNP分析，遗传背景分析生物物种鉴定，系统进化研究基因表达量研究（real-time PCR）/基因表达谱研究（DNA chip,SAGE）,医学领域,疾病基因检测/遗传病的产前诊断致病病原体
5、的检测 肿瘤治疗中癌基因的检测 会推广到大部分疾病治疗前的检测 DNA指纹、个体识别、亲子关系鉴别、法医物证 其他:动、植物检疫（转基因动植物检测）,PCR仪器的变迁,三个水浴锅，用手移动（Mullis等人当时用的）电加热块 自来水冷却（PE，1988）电加热块 内置循环液冷却（PE，1989）三个加热块 机械手（Stratagene，1994）半导体制冷和加热（MJ,PE,BioMetra,Eppendrof）温度梯度,荧光检测(如 Roche的Lightcycler)风加热Lab-on-chip式的PCR仪(所谓的芯片PCR)中国的状况1991年出现三个水浴锅+机械手的原始PCR仪（华美，
6、复日等）现在以半导体（Peltier板）制冷式为主（杭州博日,上海天呈,厦门安普利等）,耐高温DNA聚合酶的种类,Taq DNA聚合酶(Thermus aquaticus，Cetus/Roche)Tth DNA聚合酶(Thermus thermophilus，Toyobo)Pfu DNA聚合酶（Pyrococcus furiosus，Stratagene）Deep Vent DNA聚合酶(Bio-labs）Tfl DNA聚合酶（Thermus flavus，Promega)Tli DNA聚合酶(Thermococcus litoralis，Promega)Vent DNA聚合酶(Bio-lab
7、s）Pwo DNA聚合酶(Pyrococcus woesei，Roche)Pfx DNA聚合酶(Thermococcus kodakaraensis,Invitrogen)Dynazyme DNA聚合酶（Thermus brockianus，Finnazyme）FD DNA聚合酶(Thermus sterophilus？，复旦大学)Tma,Tne,KOD,PCR相关的术语和产品层出不穷,T-vectorHotStart TaqRT-PCRRAPD-PCRDDRT-PCRLM-PCRInverse PCRNested PCRReal-time PCRRACEFlow chip PCR,TASMu
8、ltiplex PCRImmuno PCRAsymmetric PCRLP-PCRNASBA Recombinant PCR AFLPSSCPIn situ PCRTaqMan/SYBR green,从定性到定量的革命,PCR 动画,1st cycle,2nd cycle,3rd cycle,过 程,变 性,引 物 退 火,DNA 复制,PCR产物生成曲线,logDNA,Cycles,PCR,琼脂糖凝胶电泳,最终产物,紫外光观察,3-4 小时,PCR具有极高的灵敏度,样品,正对照,负对照,标准分子量,污染是PCR实验的常见问题。只要实验室里曾经扩增过某个片段，就有可能以后的实验中发生污染。,因
9、此，做实验的时候绝对不要忘了负对照。用紫外灯破坏污染物也是一个办法,logDNA,Cycles,不同样品有不同的生成曲线,普通PCR和定量PCR的区别,适用定性分析，不适合定量分析；PCR 产物的长度从100bp 数kb,实时检测:每个循环都产出荧光信号绝对定量，灵敏度更高 PCR产物的长度一般在 60-150 bps,定量PCR相关的近年来国际学术刊物上发表的论文数,1996,1997,1998,1999,2000,2003年已经达到3000篇,Real-Time PCR，SYBR green,Molecular Probe公司的一个专利产品，US Patent5,436,134 1993年
10、7月12日申请,SYBR green 的优缺点,简便可以使用已有的引物普遍通用可以检测所有的双链DNA，包括引物二聚体；需要化大力气优化反应条件，以消除非特异性扩增；价格$1/PCR 反应定量的灵敏度有所欠缺,定量 PCR，TaqMan体系,ABI 公司首先推出(PRISM 7000系列)US Patent 5,723,591,1995年11月申请。实时检测:每个循环都会产生与PCR产物成正比的荧光物质,TaqMan系统的一个例子,10ng,0.001ng,Titrate a template;10,1,0.1,0.01,0.001 ng,Taqman的优缺点,单一荧光系统中不能在同一管中进行多片断扩增 不同的基因必须在不同的试管中管之间的精确度跟多荧光系统同等的精确和 可靠灵敏度高，定量方便费用高多种荧光提供仪器价格比较贵,PCR会用于基因身份证的制作吗？,到2030年，预计只要1000美金就能得到个人的基因组序列。人与人之间平均1000个碱基对就有一个碱基呈多态性(SNP)。因此共有300万碱基上可能存在差异,而真正有价值的SNP也许只有12万个。防治基因信息的滥用和基因歧视，将是今后社会的重任。,利用定量PCR进行SNP定型,/附加：http:/taxonomy.zoology.gla.ac.uk/rcruicks/additives.html,PCR的网上资源,谢谢各位,
