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1、RhD(-)血型的研究进展,合肥市红十字会中心血站吕蓉2008-5,RH血型的研究历史,19世纪40年代发现了人类红细胞RH血型19世纪60年代,发现了RH血型不合的有效治疗方法19世纪80年代,成功分离了RH蛋白19世纪90年代,认识了RH基因结构20世纪90年代,清楚了RHD和RHCE的氨基酸序列,RH血型系统的发现,1940年,发现多数人红细胞上有一种血型抗原物质,与恒河猴（Rhesus monkey)红细胞的抗原物质是相同的.1940年还发现,三例ABO血型相同，同种输血后却发生了严重的输血反应.同一年，一名O型孕妇产后大出血，输入O型丈夫的血液后发生了溶血性输血反应，这是人类由于妊娠
2、产生的同种免疫作用的第一例报告这就表明除ABO血型系统外,还存在另外的血型系统.,RH血型系统的命名,“Rh”是根据恒河猴英语单词的前两位字母而由来我们现在通常把红细胞上含有D抗原的称为RH阳性，而不含有D抗原的称为RH阴性RH系统还有C、c、E、e 四种抗原，也有用1、2、3、4、5来表示，D+红细胞有用RH1表示，而D-细胞用RH-1来表示，相应的等位基因用R1和R-1来表示,RH血型的意义,临床意义很大!RH阴性的个体在亚洲汉族人当中很稀有,比率为0.3%左右,在欧美等白种人中,比例较高为15%左右.RH血型不合的输血,有可能产生危及生命的溶血性输血反应,母子RH血型不合的妊娠有可能发生
3、新生儿溶血病,严重者可导致新生儿死亡,或是使胎儿死于子宫内.RH血型的检查和ABO血型同等重要,已被列为血型的常规检查之一.,RH血型是如何遗传的?,RH(-)基因是隐性基因.当RH阳性的父母都带有RH阴性基因,且同时遗传给后代时,其后代即表现为RH阴性.当双亲中有一人是RH(-)时,其子女为RH(-)的机会增大.,RHD(-)有何意义?,正常RH阴性者，血浆中不含抗-D抗体，所以当RH阴性的人第一次输入RHD阳性血液时，不会发生凝集反应，但此时RH阴性者却会由于各种免疫而产生抗D抗体，当再次输入RHD阳性的血液时，就发生严重的输血反应甚至造成死亡.RH阴性的妇女怀有RH阳性的胎儿,胎儿的红细
4、胞就会刺激母体产生抗-D抗体,当再次怀有RHD阳性的胎儿时,就会导致新生儿溶血性贫血而死亡.,RHD(-)者如何自我保护?,RH阴性者在任何情况下都不能输入RH阳性的血液，必须输注相同的RH阴性血，以免由于RH不合而发生输血反应。80%的RH阴性病人在输入200MLD阳性红细胞后,在2-5个月后,血浆中可检测到抗体.RH阴性的妇女应注意婚后避免流产，保证第一胎正常分娩，以防发生RH新生儿溶血病。有资料统计14.3%的多次妊娠的D阴性孕妇产生抗-D抗体，导致新生儿溶血病。,血站为RHD(-)者做哪些工作?,常年在数以万计的供血人群中筛选RHD(-)的供者对有流产史的RH阴性的妇女，在妊娠初期做一
5、些关于RH血型系统的产前免疫检查。一旦发生RH新生儿溶血病，在新生儿刚生下来就要立即用RH阴性的同型血液进行换血治疗，挽救新生儿的生命。,表型与D抗原,Rh阳性和Rh阴性弱D和部分D（弱D表现型）D放散型（Del、DEL）,弱D型(Weak D),血清学表现为盐水介质阴性,IAT检测为阳性.D抗原数量的减少,但抗原表位数目基本不变.抗原的质量不变碱基突变形成，改变的氨基酸位于细胞膜层的中间或细胞膜层内,部分D(Partial D),红细胞缺少某些（部份）的抗原表位与正常抗原相比，抗原的质量发生了变化.(正常红细胞上抗原包含个表位）形成原因：基因单或多核苷酸碱基取代、杂交基因。所改变的氨基酸位于
6、抗原分子的细胞膜外部分.,部分的危险在哪？,许多部分的红细胞与抗直接反应，但有些需要用才能鉴定，细胞的反应强度不一样，取决于试剂的制造商部分的个体是可以产生抗，因此必须接收的血液，在日常工作中许多部分都被定为，往往在产生抗体以后才被发现,DEL型(D 放散型),盐水介质阴性,IAT检测阴性,但吸收放散试验阳性.红细胞上D抗原数目比弱还要少,红细胞上D抗原的质量也有变化的某些型红细胞抗原缺失某些表位，可以产生抗抗体.第九外显子碱基突变形成.,典型的抗原密度比较,RHD基因进化,RHAGRHceRHce和RHce复制体RHCE基因和RHD基因,RHD基因的进化,RHD基因的祖先基因是Rh 相关糖蛋
7、白基因(RHAG 基因),该蛋白有一条N多糖链.RHAG和RHD、RHCE有38%的同源性，在红细胞上具有相同的拓扑结构，由位于6号染色体上的单个基因编码。RHAG不具有多态性，所以它不携带血型抗原，但是它对RHD和RHCE定向到膜上有重要作用。没有RHAG，RHCE和RHD都不能表达到红细胞膜上.在红系的分化中先表达RHAG,然后表达RHCE,再表达RHD.RHAG基因首先复制形成Rhce基因,第二次复制发生在同一染色体短臂,形成“Rhce 复制体”,随后Rhce基因 和其复制体沿不同的途径进化,最终形成现今人类的RHD基因,而RHce 基因经过突变或与RHD基因发生交换形成常见的Rhce
8、RHcE RHCe RHCE基因.,RhD基因结构,RH基因结构目前已确定:位于染色体1p34.3-36.1,主要由RHD和RHCE两个基因组成.这两个基因的 3,端相对,相隔约有 3万bp.在它们之间为小膜蛋白1基因(SMP1),即SMP1基因.在RHD基因两侧各有一段约9000bp 的侧翼序列片段,称为RH盒子(Rhesus box)序列,5端为上游R盒子(Upstream),长9142bp,3端为下游R盒子(Downstream Rhesus box),长为9145bp,上下游盒子方向相同,与RHD基因一致.RHD和RHCE基因各由10个外显子组成,二者有43个碱基有差异,其中第1、2、
9、8外显子序列基本一致，所以绝大多数RHD基因测定中，引物选择扩增RHD基因的3-7以及9-10外显子。通常只有D抗原阳性个体拥有一或二条RHD基因，而D阴性个体则缺失RHD基因，RHD阴性个体的RHD基因缺失发生在上下游盒子之间，并形式一个融合（Hybrid Rhesus box)。,RHD基因locus,RH 和基因结构图,1p36.11,RHD等位基因的形成,基因缺失：RHD基因完全缺失形成RHD(-)单倍体；基因交换：由于RHD基因和RHCE基因在RH座位上方向相反，二个同源基因之间发生交换的机率增大，通常RHCE基因为供者基因，RHD为受者基因；碱基变异：包括突变、缺失、mRNA拼接位
10、点变异等。,近几年的研究发现,D基因结构存在种族差异,RhD(-)白种人中,D基因是完全缺失的.在黑人中,RHD（-）个体，D基因却完整存在，66%的D基因在第3内含子和第4外显子之间有37bp的插入片断，导致了抗原的不表达。黄种人中RhD(-)个体表现出明显的多态性.,黄种人D基因的多态性,D基因完全缺失(10个外显子全部缺失)导致了D抗原的不表达.D基因的部分缺失,(有两边缺失和中间缺失)导致D抗原的不表达.D基因完整存在,(碱基突变),导致D抗原不表达.,RHD基因阳性、D抗原阴性等位基因 基因交换形成的融合等位基因,RHD基因阳性、D抗原阴性等位基因 碱基变异形成的等位基因,Del等位
11、基因,all DEL alleles are associated with Ce,K409K又叫1227A,指第九外显子最后一个基因GA突变，也是第九外显子与第九内含子拼接位点的碱基突变，虽然位置氨基酸末改变，但是剪接点突变导致产生了不正常的抗原,弱D等位基因（种）,部分D等位基因,中国人RhD分子背景,中国人RhD分子背景,D阳性个体的RHD基因与在其它民族中报道的正常RHD基因序列相同；真实D阴性中国人中以RHD-CE(2-9)-D2等位基因为主，比率为10.5%；同时还存在比率不低的个体因碱基变异导致RHD基因ORF错位，导致正常D抗原不能表达。在真实D阴性中国人中RHD基因总阳性率为
12、15.8%,中国人RhD分子背景,中国人Del个体主要携带RHD 1227A等位基因(K409K)。该等位基因是Genbank收录的第一个Del等位基因(GenBank记录AF390110)，但也是中国人中唯一发现的Del等位基因，而在欧洲人中除RHD1227A等位基因外，还观察到另外几种Del等位基因弱D表型个体目前发现主要是弱D15型、还发现了2例RHD 1227A等位基因携带者；部分D表型观察到DVa(Hus)和DVI III型。,中国人RHD等位基因,RHD基因分型技术的应用,血清学定型结果难以判定,为了防止某些弱D被误定为RH-,用分子生物学检测作为辅助手段；D抗原弱阳性个体的弱D型
13、或部分D型别的鉴定；通过羊水预测胎儿的D表型；慢性多次输血患者、大量输血患者、同种免疫或自身免疫溶血性贫血患者、以及红细胞直接抗球蛋白实验阳性患者的D抗原表型的检测和纠正；对于中国人，鉴定Del表型,中国人RHD的未来研究方向,真实D阴性个体RHD基因序列研究，进一步了解产生中国人D抗原阴性的特性分子机制，发现更多的RHD等位基因：D抗原弱表现型个体的分子背景研究，用以了解中国人弱D和部分D表型的常见型及频率。目前在中国人中观察到的弱D型是弱型和二种部分D型，而国际上报道的弱D型确有很多种，而不同分子机制形成的其它部分D表型也很多,中国人RHD的未来研究方向,有关Del研究，Del在中国人中比率非常高，综合近几年的文献，在经IAT确认的D阴性群体中平均为28.1%。尽管目前国家没有要求DEL型血液不能供应给临床,但是从理论上来讲,DEL型是有可能刺激机体产生抗体的。稀有血型的分子生物学研究和调查。,感谢各位专家和同行！,
