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1、,RNA干扰及应用RNA Interference(RNAi),Genomics:Whats Next?,HapMap,Systems Biology,Dogmatic View of Gene Expression,Post-transcriptional Control:,Quantitative Control:Levels of mRNA not proportional to levels of mRNA synthesized or protein producedQualitative Control:More than one protein from a single gen
2、e(e.g.Differential RNA Processing or RNA editing),An“RNA-Centric”View ofGene Expression,RNA,DNA,Protein,一.RNA干扰的简介,RNA干扰作用(RNA interference，RNAi）双链RNA(doublestranded RNA，dsRNA)引发的转录后基因沉默机制(post transcriptional gene silencing,PTGS)。,目前对RNAi 的定义有很多种，不同的资料对其定义的侧重点也不尽相同，如果将RNAi看作一种生物学现象，可以有以下定义：RNAi是由ds
3、RNA介导的由特定酶参与的特异性基因沉默现象,它在转录水平、转录后水平和翻译水平上阻断基因的表达。RNAi是有dsRNA参与指导的，以外源和内源mRNA为降解目标的转基因沉默现象。具有核苷酸序列特异性的自我防御机制，是一种当外源基因导入或病毒入侵后，细胞中与转基因或入侵病毒RNA同源的基因发生共同基因沉默的现象。,RNAi的定义,1990,Jorgensen et al材料：petunias 目的：得到紫色更深的花;方法：构建强启动子的苯基苯乙烯酮合酶表达载体，导入 牵牛花;结果：花变得更白;分析：内源和外源的苯基苯乙烯酮合酶基因的表 达都被抑制,称之为共抑制(cosuppression).,
4、二.RNAi发现史,1995年，Guo S等试图阻断秀丽新小杆线虫（C.elegans）中的par-1基因的表达。设计：反义RNA 特异性地阻断par-1基因的表达；正义RNA 以期观察到基因表达的增强。结果:二者都同样地切断了par-1基因的表达途径。这 是与传统上对反义RNA技术的解释不相符合。该 研究小组一直没能给这个意外以合理解释。,直到1998年2月，Fire A和Mello C才首次揭开这个悬疑之谜。他们将体外转录得到的单链RNA纯化后注射线虫时发现，基因抑制效应变得十分微弱；而经过纯化的双链RNA却正好相反，能够高效特异性阻断相应基因的表达。他们证实，Guo S博士遇到的正义RN
5、A抑制基因表达的现象，以及过去的反义RNA技术对基因表达的阻断，都是由于体外转录所得RNA中污染了微量双链RNA而引起。该小组将这一现象称为RNA干扰（RNA interference，简称RNAi）。,2002 Science杂志评为“2002年的重大突破”2006 Nobel Prize in Physiology or Medicine,真核生物：真菌、果蝇、拟南芥、锥虫、水螅、涡虫、斑马鱼等。RNAi在不同物种的表现形式：植物中的转录后基因沉默、共抑制及RNA介导的病毒抗性、真菌的抑制现象。,RNAi广泛存在于自然界,三.RNAi作用机制,起始阶段,效应阶段,扩增扩散阶段,起始阶段,长
6、dsRNAsiRNA 21-23ntATP,RNase特异核酸酶(Dicer,果蝇)切割产生的siRNA 是有3羟基末端和5磷酸基团的双链形式,dsRNA,RISC,效应阶段,RISC binding targeted RNA,siRNARISC(RNAinduced silencing complex)ATP活化的RISC在单链siRNA引导下识别互补的mRNA，并在RISC中的核酸内切酶作用下从siRNA引导链中心所对应的靶基因位置切割靶mRNA，最后可能再被核酸外切酶进一步降解，从而干扰基因表达。,模板：靶mRNA切割片段引物：siRNA产物：长链dsRNA依次循环：新合成的长链dsRN
7、A同样可被Dicer切割、降解生成大量的次级siRNA。次级siRNA又可进入合成一切割的循环过程，进一步放大RNAi作用。,扩增扩散阶段,重要特征：只对exon有效，对intron和promoter无效，尚未发现对染色体DNA有影响RNAi具有很高的特异性放大性 RNAi的效应可以穿过细胞界限，在不同细胞间长距离传递和维持,四.RNAi应用,对抗由转座子和重复序列引起的不稳定性对抗病毒等外源性物质的侵入内源基因调控:探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗,由于RNAi能高效特异的阻断基因的表达，因而RNAi成为研究基因功能的很好的工具。,1.研究基因功能,人们已经开始利用RNAi技术从
8、基因组水平分析哺乳动物体内基因的功能，可以更迅速地鉴定出许多与疾病相关的基因。,黄国忠等 RKN(根节线虫)分泌肽编码基因16D10证实这种寄生基因在根节线虫的植物寄生过程中起到关键作用。,Zimmermann等人对为猕猴的阿朴脂蛋白B(ApoB)编码的基因施用siRNA，成功降低ApoB蛋白、血清胆固醇和低密度脂蛋白的水平。这是首次在非人类灵长类动物中有关RNAi的全身用药，是RNAi在药物治疗方法上的重要进展。,2.基因治疗,RNAi可以特异性的抑制基因表达，所以可用于基因病、病毒感染、癌症的治疗。,RNAi是机体中古老而天然的抗病毒机制。目前利用RNAi抗病毒感染的研究已经展开，主要集中
9、在肝炎病毒、HIV病毒。,Jacque等针对HIV.1基因组的LTR(Longterminal repeate，LTR)、vif和nef设计了siRNA，将siRNA转染进HIV后，这些基因的水平降低了95。,RNAi转基因小鼠,运用RNAi技术，设计针对c-myc基因的siRNA可以有效地干扰K562细胞中c-myc的表达，并进一步诱导细胞凋亡。利用RNA干扰成功构建针对突变p53的RNA干扰载体，此干扰载体可以有效降低p53蛋白表达水平，导致突变p53基因沉默，进而延缓PLCPRF5细胞生长速度，阻滞肿瘤细胞停滞于G1期。,RNAi可用来研究细胞信号转导通路和细胞生长分化过程。Clemen
10、s等应用RNAi研究了果蝇细胞系中胰岛素的信号转导通路，证明RNAi技术较传统的转染实验简单、快速、重复性好，克服了转染实验中重组蛋白特异性聚集和转染效率不高的缺点。2004年，Jin等人利用果蝇作为模式生物发现在FMRP参与神经元发育和突触生长的过程中，argonau-1起了重要作用，证明FMRP能够调节miRNA信号通路。,3.信号转导,人们对RNAi的研究只有短短的几年时间，但进展却极为迅速。可以认为RNAi是一个以小分子RNA为中心的真核细胞基因表达调控系统，它可以在多个层面调节基因表达和细胞的增殖分化，通过对RNAi的研究将会使人们对生命现象的认识更加深入。随着后基因组学时代的到来，
11、RNAi作为有效、经济的分析基因功能的技术，已逐渐成为分析包括原生动物在内的所有生物基因功能的有力工具。,五.RNAi展望,RNAi文库的建立可以便利地开展更多的遗传学研究，这就意味着将有越来越多基因的功能被揭示，可望进行高通量的基因功能分析。而且它还为人们预防和治疗癌症和病毒疾病提供了新的思路，给寄生原虫病的基因治疗、新药开发和生物医学等应用研究领域带来新的变革。,由于对RNAi分子机制的了解尚不十分明确，目前对dsRNA和siRNA的设计还属于经验性过程，实验设计尚需进一步完善。现有的研究主要集中在模式生物中，是否所有基因的表达都能用RNAi来由于抑制尚不确定，将dsRNA加工成siRNA的类似Dicer的核酸酶也尚未在原生动物的基因库里找到。,此外，又发现另一种小分子RNA就是piRNA：Piwi蛋白代表着Ago蛋白家族中的一个分支，首次在果蝇(Drosophila)中发现，随后也发现哺乳动物的Piwi蛋白成员调节着生殖细胞的成熟。与哺乳动物Piwi蛋白结合的小分子RNA被称为piRNAs。该类新型小分子RNA的证实为确定哺乳动物中精子形成过程中的Piwi蛋白的作用提供了起点。这些都将是今后的研究方向。尽管目前的研究离真正应用还有一段距离，但作为一项极具潜力的新技术，它将给生命科学带来新的期望。,Thank you!,
