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1、,生物制药09303第七组指导老师：陈芬,（一）操 作 方 法,背景知识,核糖核酸，简称RNA，主要以单链的形式存在于生物体内,其高级结构很复杂,它们既担负着储藏及转移遗传信息的功能,又能作为核酶在细胞内发挥代谢功能。生物体内共有三种RNA，即编码特定蛋白质序列的信使RNA；能特异性解读mRNA中的遗传信息、将其转化成相应氨基酸后加入多肽链中的转运RNA；直接参与核糖体中蛋白质合成的核糖体RNA。,mRNA的选择性拼接 合成类RNA,RNA的生物合成 RNA/DNA诊断仪,实验目的,1 掌握从动物组织中提取RNA的基本原理和操作2 掌握RNA纯度鉴定的原理和基本操作3 进一步熟悉可见分光光度计
2、的使用,实验原理,细胞内大部分RNA均与蛋白质结合在一起，以核蛋白的形式存在。因此分离RNA时必须使RNA 与蛋白质解离，并除去蛋白质。最常用含水的酚溶液除去蛋白质，去污剂和酚均能抑制RNA酶活力，有利于制备核酸大分子，以酚水两相系统分离RNA是将细胞或细胞器置于含有SDS的缓冲盐溶液中，加等体积水饱和的酚，通过剧烈振荡，然后离心形成上层水相和下层酚相。实验所用的0.15mol/L缓冲盐溶液系统可使大部分核糖核蛋白解离，在用酚处理时脱氧核糖核蛋白变性；在低温条件下，从水相中除去，这样得到的RNA 制品中混杂的DNA量极低,RNA制品继续用氯仿异戊醇处理，可以进一步除去其中含有的少量蛋白质。最后
3、用乙醇使RNA自水溶液中沉淀下来。实验所得制品的核酸含量可用地衣酚显色法测定RNA含量。RNA与浓盐酸共热时，即发生降解，形成的核糖继而转变为糠醛，后者与3，5-二羟基甲苯（地衣酚）反应呈鲜绿色，该反应需用三氯化铁或氯化铜作催化剂，反应产物在670nm处有最大吸收。RNA在20250 g范围内，光吸收与RNA的浓度成正比。,实验器材与试剂,器材：乳钵、磨口 具塞锥形瓶(500ml)天平、离心机（4000rpm）动物肝脏、紫外可见分光度计、恒温水浴锅,试剂：,1.SDS-缓冲盐溶液0.3%SDS-0.1mol/L氯化钠-0.05mol/L，pH5.0乙酸盐缓冲液称取1.5gSDS，2.92g氯化
4、钠，2.05g乙酸钠溶于水中，用乙酸调至pH5.0，最后定容至 500ml。2.含水酚液：使用前将苯酚重蒸(酚的沸点为181.8)并用SDS缓冲盐溶液使其饱和。3.氯仿-异戊醇液：氯仿：异戊醇=24:1(V/V)。4.含2%乙酸钾的95%乙醇溶液。5.75%乙醇，95%乙醇、无水乙醇。6.乙醚7.RNA标准溶液（须经定磷确定其纯度）：取酵母RNA配成200 g/mL的溶液。8.地衣酚试剂：先配制0.1%三氯化铁的浓盐酸（分析纯）溶液，实验前用此溶液作为溶剂配成 0.1%地衣酚溶液。,实验步骤,一.实验前的准备mRNA的分子结构容易受到RNA 酶的攻击反应而降解,加上RNA 酶极为稳定而且广泛存
5、在,因此在提取过程中应严格防止RNA 酶的污染并设法抑制其活性。所用的玻璃器皿需要置于干燥烘箱中 200.0C烘烤两小时以上,凡是不能用高温烘烤的材料如塑料容器等可用0.1%的焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶液处理，再用蒸馏水冲净。,RNA提取流程,二.实验过程1.取2g动物肝脏组织，剪成小块，在乳钵种研碎，加20mLSDS-缓冲盐溶液（见试剂1.）使成均浆，倒入磨口具塞锥形瓶内，再加同样体积的含水酚溶液，室温下剧烈振荡10分钟。2.置冰浴中分层，在0-4下，以4000rpmn离心15分钟。吸出上清液，加等体积氯仿异戊醇，室温下剧烈振荡10分钟，以4000rpm离心5分钟，或在室温下放置10分钟使
6、分层。吸出上清液（若有必要，该操作可反复多次），加2倍体积2%乙酸钾的乙醇溶液，在冰浴中放置1小时使RNA沉淀，此沉淀液可在冰箱内较长期存放。,3.若要得到干燥制品，可将沉淀液以4000rpm离心10分钟，倾去上清液。沉淀用少许75%乙醇、95%乙醇、无水乙醇各洗1次，同上法离心，倾去乙醇后，空气干燥。4.将RNA（准确称取30mg左右RNA干燥制品）溶于510mL蒸馏水中，离心除去不溶性杂质，得RNA粗品。5.RNA纯度的鉴定一、RNA标准曲线的制定取8支试管，编号，按表加入试剂。加毕，摇匀，置沸水浴中加热15min，冷却，测OD670值。以OD670值为纵坐标，RNA含量（ug/ml）为横
7、坐标绘制标准曲线。,二、制品的测定取0.20.5ml制品液于试管中，加蒸馏水稀释至2ml，然后加2ml地衣酚试剂摇匀，于沸水中煮沸15分钟，冷却，测OD670。根据测得的吸光度，从标准曲线上查出相当该吸光度的RNA的含量。三、RNA含量的计算根据测得的光吸收值，从标准曲线上查出相当该光吸收值的RNA含量。按下式计算出制品中RNA的百分含量：样品液RNA含量(ug/ml)=标准曲线查到的值稀释倍数,操作参照表,注意事项,1：在操作中当加入变性剂氯仿后，为了保证核酸样品的完整性，操作要轻，尤其在提DNA时，更要避免剧烈操作2：在沉淀核酸时可用乙醇与异丙醇，乙醇的极性要强于异丙醇，所以一般用2V乙醇
8、沉淀，但在多糖、蛋白含量高时，用异丙醇沉淀可部分克服这种污染，尤其用异丙醇在室温下沉淀对摆脱多糖、杂蛋白污染更为有效。,3：在提取核酸时，如样品浓度低，则应增加有机溶剂沉淀时间，70下30min;20过夜将有助于增加核酸的沉淀量。4:RNA通常用分光光度计定量，测量在260 nm处的吸收值（A260）。通常分光光度计A260的读数要介于0.15-1.0之间才是可靠的，因此RNA提取结束后，要根据大概产量稀释到适当浓度范围，再用分光光度计测量。A260为1相当于RNA的浓度为40 g/ml。,问题及答案,一、提取制备RNA常用的方法有那几种？主要有苯酚、异硫氰酸胍、CTAB、LiCl密度梯度、Trizol等方法。二、制备RNA应注意哪些问题.1.整个过程应注意预防RNA酶的污染 2.匀浆后加氯仿之前样品可以在-60至-70保存至少一个月。三、地衣酚反应中，干扰RNA的测定因素有哪些？如何能减少他们的影响？1.DNA，地衣酚反应特异性较差，凡戊糖均有此反应，DNA及其他杂质也有影响。故一般测定RNA时，可先测定样品中DNA含量，再算出RNA含量。2.蛋白质，本法较灵敏。样品中蛋白质含量高时，应先用5%三氯醋酸溶液将蛋白质沉淀后再测定，否则将发生干扰。,
