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1、1,SNPs的检测方法,唐敏,2,主要内容,SNPs的定义SNPs的研究意义SNPs的研究进展和方向SNPs的检测方法,3,SNPs的定义,定义：单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。(99.9%),4,SNPs的研究意义,1.SNPs作为第三代遗传标记（已知性、可遗传性、可检测性），用于疾病基因的定位、克隆和鉴定。_路标的作用传统研究策略（表征、蛋白、基因）逆向遗传学（表型、基因、蛋白），,5,2.基因多态性研究 研究SNPs本身对机体的影响（生理特征、病理条件下的千差万别）
2、,6,SNPs研究进展和方向,1.SNPs数据库的构建发现2.SNPs功能的研究（在1的基础上）,7,SNPs检测方法,1.理想的检测SNPs的方法 发现未知的SNPs，或检测已知的SNPs(1)灵敏度和准确度的要求（反应原理严紧）(2)快速、简便、高通量(操作和分析的自动化程度高）(3)费用相对低廉,8,2.现状：到现在还没有一个符合以上条件的理想方法出现,但根据实际情况,可以选择出较合适方法。,9,3.每种SNPs的检测方法都可将之看成由 区分SNPs特异位点的原理方法 和 数据的检测分析手段 两部分组成。,10,SNPs检测方法的分类,一、区分SNPs 位点的方法 1.基于杂交的方法 2
3、.基于酶的方法 3.以构象为基础的方法 4.直接测序的方法,二、检测分析技术 1.凝胶分析技术 2.荧光检测技术 3.DNA 芯片 4.质谱检测技术,11,1.基于杂交的方法,原理:短的核苷酸探针在和互补的目的片段进行杂交时，完全匹配和有错配两种情况下，根据杂交复合体稳定性的不同而将SNPs 位点检测出来。（差异越大，检测的特异性就越好）,12,1）利用Tm,固定温度 等位基因特异核苷酸探针(Allele-specific oligonucleotide，ASO)。修饰过的探针：引入一个错配的碱基、PNA、LNAs 等 动态的加热过程 动态等位基因特异杂交(dynamic allele-spe
4、cific hybridization,DASH),13,核酸肽探针（Peptide nucleic acids，PNA),其骨架是肽键特点：1、与靶分子高特异性地结合（3个方面的影响）2、链挤入（形成三链复合结构）（表达调控以及反义治疗方面）3、对核酸酶和蛋白酶均不敏感（体外应用）,14,1、与靶分子高特异性地结合,Tm值高受盐浓度影响小（低盐浓度的体系）Tm更大（一个PNA碱基的错配会使其Tm值降低8-20度）所以，PNA/DNA的非特异结合能得到很好的排除。,15,LNA(locked nucleic acids),其结构是在RNA分子的2羟基和核糖环的4碳原子间连入一个亚甲基的“桥”。
5、特点：1.能以很高的亲和性和互补的DNA、RNA 或LNA 结合（构象更利于杂交的稳定）2.匹配和不匹配的Tm增加,16,DASH(dynamic allele-specific hybridization）,17,2）杂交+荧光共振,分子信标（双分子间杂交）蝎状探针（分子内杂交）,18,分子信标（Molecular beacons）,19,蝎状探针（Scorpion primer）,20,2.基于酶的方法,1）DNA聚合酶2）连接酶3）限制性内切酶4）外切酶FEN5）RNase H,21,1）DNA聚合酶,等位基因特异性PCR多重等位基因特异性PCRTaqman法引物延伸法焦磷酸测序法,22
6、,等位基因特异性PCR,23,Taqman 法,24,微测序法/引物延伸法,25,基本步骤（液相）,1.设计PCR扩增含SNPs位点的一段DNA2.对PCR产物进行纯化（去除引物和dNTP)3.引物延伸4.延伸产物检测（放射性同位素标记法、发光检测法、凝胶为基础的荧光检测法、质谱分析法、变性高压液相色谱法等）,26,APEX(arrayed primer extension)固相,27,焦磷酸测序法(Pyrosequencing),DNA 聚合酶、ATP 硫酸化酶(ATP sulfurylase)、荧光素酶(luciferase)和三磷酸腺苷双磷酸酶(apyrase)。原理：DNA 聚合酶在一
7、种dNTP的存在下进行引物延伸反应,而引物的成功延伸将伴随焦磷酸的释放,焦磷酸在荧光素酶的存在下能引一种发化学发光反应,通过发光计的实时监测来达到检测的目的。,28,基本步骤,1.测序引物和DNA模板杂交（PCR扩增的、单链的），与酶和底物孵育。2.四种dNTP（dATPS，dTTP，dCTP，dGTP）之一被加入反应体系，如与模板配对，与引物的末端形成共价键，dNTP的焦磷酸基团（PPi）释放出来。3.一系列的酶学反应，发出可见光信号。每个光信号的峰高与反应中掺入的核苷酸数目成正比。4.ATP和未掺入的dNTP由三磷酸腺苷双磷酸酶降解，淬灭光信号，并再生反应体系。5.然后加入下一种dNTP。,29,30,2)连接酶,联合链式反应(combined chain reaction,CCR)连接-滚环扩增反应(ligation-rolling circle amplication,LRCA),
