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1、生物梅里埃公司将质谱技术实现于临床细菌检测和鉴定的常规分析,2,现代微生物的分类:蛋白质组及基因组,质量指纹图谱 基因指纹图谱,什么是质谱Mass Spectrometry?,定义：用电场和磁场将运动的离子（带电荷的原子、分子或分子碎片）按它们的质荷比分离后进行检测的方法。20世纪初，创制了抛物线质谱装置：阴极射线在电场作用下发生偏转。,质谱仪简单构造,进样系统,离子源,质量分析器,检测器,基本构造及功能（高真空系统）：首先，在离子源中，使分子离子化；其次，带电分子的离子及其碎片必须根据其质荷比来得到分离，这往往在质量分析器中进行；最后，分离的带电荷的碎片必须通过检测器检测。,离子源分类,用于
2、同位素质谱、无机物质谱、有机物质谱的电离方式电子轰击电离（electron impact,EI)化学电离（Chemical ionization,CI)大气压化学电离（atmospheric pressure chemical ionization,APCI)然而以上电离方式产生的能量传输容易导致蛋白质破碎，故不适用于生命科学,离子源分类,诞生于20世纪80年代的软电离技术，具有高灵敏度和高质量检测范围。使得在pmol（10-12甚至fmol（10-15的水平上准确地分析分子量高达几万到几十万的生物大分子成为可能，从而使质谱技术真正走入了生命科学的研究领域 电喷雾电离（Electro spra
3、y ionization,ESI)快原子轰击（Fast atom bombardment,FAB)基质辅助激光解吸电离质谱技术 MALDI-TOF(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation-Time of Flight)最柔软的电离方式保证完整分子量信息，例如蛋白质/多肽;直接从细菌核糖体中筛选蛋白质;一般都使用飞行时间检测器（Time of Flight）来检测，故名。,MALDI的原理和特点,最新“柔软”电离技术，它允许完整检测生物分子 原理如下：将分析物分散在基质分子中并形成晶体，当用激光照射晶体时，由于基质分子经辐射所吸收的能量，导致能量蓄
4、积并迅速产热，从而使基质晶体升华，致使基质和分析物膨胀并进入气相 广泛的质量范围 质谱图多为单电荷离子，因而质谱图中的离子与多肽和蛋白质的质量有一一对应关系。可以鉴定混合菌种，但需要先提纯高灵敏度（1000 CFU）高分辨率和质量图谱更准确,诞生过程,梅里埃的承诺,2009:bMx internal mass spec developments收集所有的菌种，建立临床应用的细菌数据库 May 2010:收购 SARAMIS细菌数据库（+2000个菌种，+60000谱）June 2010:与 合作Co-development to optimize mass spectrometry for m
5、icrobiology laboratoriesShimadzu 发明 MALDI-TOF,微生物体外诊断领导者,知识产权,欧洲共同体专利 EU1253622-E1Method of identifying microorganisms using MALDI-TOF-MSGranted December 2007,利用MADLI-TOF质谱鉴定微生物,1987:Shimadzus Koichi Tanaka introduces his cobalt/glycerol matrix for MALDI in Takarazuka Japan 2002年，田中耕一获得诺贝尔化学奖。,与MALD
6、I发明家合作开发,原理示意图,简单工作流程,步骤 1,步骤 2加入基质,步骤 4 上机,步骤 5 开始读数及分析,样品靶,细菌、霉菌、酵母、分枝杆菌的菌落,步骤 3 空气干燥几分钟,MALDI 原理示意图（1）,激光,样品(A)与基质(M),样品靶,+,+,+,+,+,用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜过程中将质子转移到生物分子MH+A M+AH+,基质附助激光解吸电离离子源（MALDI）,TOF 飞行时间质量分析器（2）,Linear time-of-flight mass spectrometer,l mass range up to 500 kDa,TOF的原理是离子在电场作用下加速飞
7、过飞行管道，根据到达检测器的飞行时间不同而被检测离子的质荷比（M/Z）=离子的飞行时间成正比,+,+,+,+,飞行时间的结果会显示在示波镜和电脑上,离子检测器（3）,17,MALDI-TOF MS at a glance,工作流程,今天具备.,主要组合样品准备工作站VITEK MS主机（MALDITOF）数据采集工作站Myla（连接LIS）,为感染治疗服务的质谱系统,标本准备工作,direct,addition of,1.0 L matrix solution,solvent evaporation,at room temperature,automated,MS analysis,MALDI
8、 target,样品板低成本,每块样品板有条形码、48个检测孔及3个对照，可以分开3次使用，即每16个测试包含1个质控。,商品化的试剂,高通量,4位技师同步准备4 x 48 spots=192 标本/批可追溯性及内部质控节省时间,速度快：以“分钟”计,1分钟完成1-2菌株鉴定,VITEK MS标本准备工作站,可追溯性扫描样本板条码输入每个标本号码整合VITEK 2 AST,VITEK MS 数据采集工作站,实时显示实验 进程提示需要重新测试的样品,VITEK MS 数据采集工作站,VITEK MS检测核糖体蛋白质,重复性高：检测固定表达的高含量蛋如核糖体蛋白 宽泛的质量范围2000-20000
9、道尔顿,The ribosome of E.coli has about 22 proteins in the small subunit(labelled S1 to S22)and 34 proteins in the large subunit(L1 to L36).,质控菌株 ATCC 8739 E.coli cells,For E.coli K12 strains a number of exact average protein masses are known that are used as calibrants,细菌质量指纹图谱,扩展到新的菌种和应用（用户不断增加细菌数据库）
10、,检测细菌的核糖体蛋白不同波形代表不同菌种,MylaTM 主脑,Myla:VITEK MS 状态,Myla:VITEK MS 结果分析,Myla:VITEK MS结果分析,VITEK MS/Myla:,MylaTM服务器,VITEK MS 数据处理分析,准备工作站,VITEK2 ID/AST,LIS,工作流程,信息流程,BacT/Alert,强大的菌种库供您选择,VITEK MS RUO,科研用途Saramis 数据库2000+菌种临床环境,VITEK MS,体外诊断利用MYLA连接鉴定及药敏检测近800临床菌种细菌酵母菌/霉菌/皮肤癣菌 分枝杆菌,VITEK-MS 体外诊断菌种库,临床菌种覆
11、盖一般细菌酵母/霉菌分枝杆菌覆盖了微生物学实验室出现的大多数菌种大中华区菌种库合作计划,开启微生物研究新时代,临床微生物常规鉴定,现在情况:细菌和酵母菌株的鉴定主要是根据表型试验包括革兰氏染色，培养和生长特性和生化试验可靠的方法但耗时鉴定结果在第二天,需要更快的鉴定结果以改善病人护理和提供适当抗生素疗法,MALDI-TOF MS：质的飞跃,轻松、快速诊断人类病原体证明是一个可靠和快速的方法,进行中的革命性改变:,在几分钟内得到鉴定结果=关键信息做药敏试验,MALDI-TOF MS 鉴定某些重要微生物具有明显优势,酵母菌 传统方法 比较难以确定及耗时 非常简单从培养基挑选菌落(MALDI-TOF
12、 MS)分枝杆菌生长时间：不同菌种,时间不同使用MALDI-TOF MS:更快，更便宜的分子方法中和步骤需要BSL3阳性血培养瓶 非常关键快速鉴定血液感染的微生物 传统方法：传代+检测 鉴定结果需要最小24小时后 MALDI-TOF MS:提纯步骤 MALDI-TOF MS:鉴定病原最少快1天,优势,更简单：无需革兰染色更灵活：所有的微生物只需简单样品制备，即可鉴定更准确：满足临床+科研的需要 样板板有可追溯条形码(ISO 15189)更快速：出结果时间以“分钟”计高通量：可同时检测192个样本低成本：,功能评估（1）,JCM,Apr 2010720 clinical isolates tes
13、tedSARAMIS result for 639 isolates99.4%correctBruker result for 680 isolates99.1%correct,功能评估（2）,Sept 20101021 clinical isolates testedSARAMIS:98%correct IDsPhoenix:90%correct IDsAdditional 138 rare clinical strains testedSARAMIS 76%concordant ID with Phoenix and/or 16SAssumingly remaining strains n
14、o ID(%incorrect ID not mentioned),比Phoenix准确度更高,稳健性,Mass spectra of Proteus mirabilis DSM 4479 grown on Columbia agar,Major mass signals are still recorded after 120 h incubation,SARAMIS identification successful for all incubation times,No influence of incubation time over a wide span,不受培养时间的影响,Mass spectra of Enterobacter aerogenes DSM 30053grown on three different standard media for 24 h,Major mass signals are recorded in all samples,SARAMIS identification successful for all growth media,No influence of growth medium on identification,不受培养基的影响,稳健性,Myla at work,如果有一天,谢谢！,
