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1、1,组织DNA提取和纯化,2,DNA的种类：真核生物DNA 细菌DNA 病毒DNA 质粒DNA,95%以上是双链线性分子,形式多样：单链环状 线状 双链环状 线状,双链环状,3,提取DNA样品的主要来源：,生物组织血液培养细胞,4,酚-氯仿抽提法（组织DNA）碱变性法等（质粒DNA）；,实验方法,5,提取DNA的总原则：1、保证核酸一级结构的完整性；2、排除其它分子的污染。,6,其它分子的污染:(1)对酶有抑制作用的物质,有机溶剂、高浓度金属离子,(2)其他生物大分子(降低到最低浓度),蛋白质、多糖和脂类,7,(3)其它核酸的污染,提取DNA时，去除RNA提取RNA时，去除DNA,8,尽量减少
2、抽提过程中各种影响因素对核酸的破坏；,实验中的注意事项：,9,各种因素对核酸的破坏：物理因素 化学因素 生物因素,过酸或过碱的环境,机械剪切力和高温,各种核酸酶的降解,pH 410,EDTA等,操作轻柔控制温度,10,实验目的 学习从生物组织中提取DNA为研究DNA的理化性质与结构功能打好基础。,11,基本步骤,DNP,DNA（RNA）,紫外定量,粉碎组织,裂解液,苯酚、氯仿,RNA酶、Protase,乙醇,纯DNA,12,裂解液（Homogenization buffer）:,试剂,1%SDS,10mmol/L pH8.0 Tris-HCl,1mmol/L EDTA,13,裂解细胞膜和核膜；
3、蛋白质变性沉淀,1%SDS（十二烷基磺酸钠）,是离子型表面活性剂,14,10mmol/L pH8.0 Tris-HCl,pH 57时 RNA比DNA更容易游离到水相中；pH 8时 DNA比RNA更容易游离到水相。,1mmol/L EDTA,抑制DNA酶活性,15,苯酚-氯仿(Phenol-Chloroform):,蛋白变性剂(有机溶剂),蛋白质,变性,酚、氯仿变性蛋白质 H20,分层,酚、氯仿,离心,DNA,16,H2O（DNA）,变性蛋白质,有机溶剂,17,酚的变性作用大于氯仿；,氯仿与水不互溶，不会带走DNA;,使用苯酚-氯仿,酚与水有一定程度互溶，大约10-15%的水溶解在酚相中，因而损
4、失了这部分水相中的DNA；,酚与氯仿是互溶的，氯仿可以带走残余的酚。,18,因为酚与水有一定的互溶，苯酚用水饱和的目的是使其抽提DNA过程中不再吸收样品中含有DNA的水分，以减少DNA 的损失。,苯酚用水饱和：,19,氯仿-异戊醇（Isoamyl-alcohol）：,异戊醇有助于分相，使离心后的分层维持稳定。,能降低分子表面张力，所以能减少抽提过程中泡沫的产生。,20,冰 无水乙醇（Absolute alcohol）,低温条件下分子运动大大减少，DNA易于聚合沉淀。,乙醇与核酸不会引起任何化学反应，对DNA很安全；,极易溶于水，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失去水而易于聚合；,可除去残
5、余的氯仿。,21,70%乙醇(70%Ethonal)：70%乙醇洗涤可去除残余的盐离子。,使DNA不易溶解并可抑制酶活性,22,TE 缓冲液（TE Buffer）：10mmol/L pH8.0 Tris-HCl 1mmol/L EDTA,缓冲对Tris-HCl不存在金属离子的干扰作用,抑制DNA酶的活性,23,10mg/ml蛋白酶K(Protase K)：,10mg/mlRNA酶(RNase)：,分解蛋白质，破坏细胞膜,分解RNA,24,5mol/L NaCl：,pH为8的DNA溶液中，DNA分子是带负电荷的，加一定浓度的NaCl使Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子间的同性电荷相斥
6、力。,易于聚合而形成DNA钠盐沉淀,25,仪器 操作 详见实验指导。,26,定量：稀释 吸光度测定（紫外分光光度计）：A260=？A280=？,27,DNA纯度鉴定：A260/A280 1.8,1.6,2.0,纯,酚或蛋白质污染,RNA污染,28,DNA浓度（g/ml）=A260nm 50 稀释倍数 1/光径,DNA的吸收峰在260nm,1 OD相当于:50 g/ml DNA 40 g/ml RNA 20 g/ml 寡核苷酸,29,DNA储存：,4或-20 存放于TE缓冲液中；,30,操作中的事项 1.处死动物取出所用脏器后应尽快放入液氮中,以免DNase引起DNA降解。在纯化过程中要加核酸酶
7、抑制剂(eg.EDTA),以防DNA自身降解。,2.组织要尽量研磨得细一点，颗粒太大细胞裂解不彻底，在随后得保温过程中会导致DNA得严重降解。,31,3.真核细胞DNA分子量很大，机械张力极易引起DNA分子的断裂，因此操作条件要缓和，摇动速度不要过快，溶液转移次数要尽量减少。,4.由于酚腐蚀性较强，摇动抽提时应戴一次性手套。,32,组织总RNA的提取和纯化,(Purification and Isolation of Total RNA),33,核糖核酸（ribonucleic acid,RNA）,RNA是在细胞核中，利用DNA作为模板合成的化学物质。在蛋白质合成中，几种不同形式的RNA起着重
8、要作用。,34,RNA的构成和种类,构成：磷酸盐;核糖;碱基,35,种类：messager RNA(mRNA)-携带DNA的编码信息从细胞核到细胞质中，在那儿被用于蛋白质的合成 ribosomal RNA(rRNA)-核糖体中发现的一种RNA transfer RNA(tRNA)-携带氨基酸到核糖体中以便它们能被连接在一起合成蛋白质,36,8085%rRNA（主要是28S、18S、5S rRNA）1015%分子量不等的小分子RNA(tRNA、核内小分子RNA等）15%mRNA,37,RNA是分子生物学研究的重要组成部分,cDNA文库的构建RNA序列分析RT-PCRNorthern Blotti
9、ng蛋白质的体外翻译,38,总RNA提取纯化的方法和原理,常用总RNA分离方法:酸性异硫氰酸胍-苯酚-氯仿一步法(acid-guanidine-phenol-chloroform,AGPC),39,异硫氰酸胍 是已知作用最强的蛋白变性剂，在裂解细胞释放RNA的同时能迅速使RNA酶失活（酸性环境有利于其活性的发挥，能最大限度地发挥其对RNA酶的抑制作用）,40,十二烷基肌氨酸钠和酚 是强的蛋白变性剂，对RNA酶也有一定的抑制作用。酸性环境下RNA、蛋白质和DNA分别进入不同的分布相中，RNA进入上层水相，蛋白质进入下层有机相，DNA则进入上下两层界面处的中间层。,41,氯仿 不但有一定的蛋白变性
10、作用，而且能迅速使各相分离，使RNA与其它成分分开。,DEPC配制的75%乙醇 洗涤（去除RNA表面的残留的有机溶剂）。,42,RNA浓度（g/ml）=A260nm40 1/光径稀释倍数RNA得量（g）=RNA浓度最终RNA原液毫升数,43,注意事项,1.实验器具预处理和配制试剂的注意点:a.经清洗烘干的玻璃器皿，必须在250烘烤4小时，不能经受高温烘烤的塑料器具，最好只用一次。b.实验中要戴一次性手套。c.RNA抽提中所用的试剂均需用DEPC处理，但含Tris的试剂除外，因DEPC遇Tris迅速分解为乙醇和CO2。,44,2.特异性RNase抑制剂的应用 钒酰核苷复合物（VRC）是一种氧化钒离子和四种核苷组成的复合物，可与RNase结合而抑制RNase的活性。常用浓度为10mM。Rnasin 是一种从大鼠肝脏或人胎盘分离得到的分子量为40000的蛋白质，对RNase有抑制作用。,45,样品中的VRC和Rnasin都可用酚抽提方法去除。焦碳酸二乙酯DEPC是RNA酶的强烈抑制剂。有致癌之嫌，须小心操作。,
