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1、蛋白质的SDS-PAGE电泳,一.实验目的,学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理。掌握垂直板电泳的操作方法。,二.实验原理,聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis)在加速剂N，N，N，N四甲基乙二胺(TEMED)和催化剂过硫酸铵(AP)或核黄素的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。,分子量范围与凝胶浓度的关系,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）：蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。如果在丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸
2、钠(SDS)，则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量，而与所带电荷和形状无关。因此可以利用SDS-PAGE测定蛋白质分子量。当蛋白质的分子量在15KD200KD之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系。,凝胶由分离胶和浓缩胶组成：上层为浓缩胶，凝胶孔径较大，没有分子筛效应，其pH为6.8，由于快慢离子所形成的高电压梯度，使得变性蛋白质分子在泳动中被压缩为很薄的一层，大大提高了分辨率。下层为分离胶，凝胶孔径较小，有分子筛效应，pH为8.8，变性蛋白质分子所带负电荷基本一致，泳动速度主要决定于分子量。,电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分子滞后,混合样品,带孔胶,按分子大小分离,
3、电泳方向,电泳,小分子,大分子,三.实验试剂和器材,1.材料：标准蛋白2.试剂：(1)30%丙烯酰胺(2)10%SDS(3)分离胶缓冲液:1.5mol/L Tris-HCl pH 8.8(4)浓缩胶缓冲液:0.5mol/L Tris-HCl pH6.8,试剂：(5)10%过硫酸铵(APS)溶液(6)四甲基乙二胺(TEMED)(7)SDS上样缓冲液:Tris-HCl、SDS、溴酚蓝、甘油、2-巯基乙醇(8)电极缓冲液（Tris-甘氨酸缓冲液）(9)染色液:甲醇、水、冰乙酸、考马斯亮蓝R250(10)脱色液:甲醇、水、冰乙酸,3.实验器材：垂直板电泳装置稳压稳流电泳仪 脱色摇床移液枪滤纸 大培养皿
4、,各部分凝胶配制,四.实验步骤,1.安装制胶模具。2.调制分离胶（10%），加入10%APS和TEMED，混匀，立即灌注至模具高度的70%。3.加一层纯水，约30min后聚合。4.倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干。5.调制浓缩胶（5%），加入10%APS和TEMED混匀，立即灌注插入梳子。静置40min。,加入分离胶溶液 pH 8.8,制备分离胶,封水的目的是使分离胶上表面平直，并排除气泡。凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。,分离胶pH 8.8,制备浓缩胶,6.样品及标准品的准备：标准品按说明书进行处理，样品加入ddH2O溶解后，再加入SDS上样缓冲液。7.加样电泳（每孔加样15l）
5、。开始8V/cm（60V），染料进入分离胶时，电压提到15V/cm（110V），继续电泳，让溴酚蓝到达分离胶底部时关闭电源。8.卸下玻板，剥离凝胶放在器皿内，切去一角作为方位标记。,浓缩胶pH 6.8,分离胶pH 8.8,上样及电泳,开始电流恒定在10mA，当进入分离胶后改为20mA，溴酚蓝距凝胶边缘约5mm时，停止电泳。,9.染色：用至少五倍体积染色液浸泡凝胶，于平缓摇摆平台上室温1h左右。10.脱色：用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，至蛋白质条带清晰。,注意事项,（1）安装电泳槽时要注意均匀用力旋紧固定螺丝，防止夹坏玻璃板，避免缓冲液渗漏。（2）凝胶配制过程要迅速,催化剂TEMED要在注胶
6、前再加入,否则凝结无法注胶。注胶过程最好一次性完成,避免产生气泡。（3）梳子需一次平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底需水平。,（4）微量注射器（加样器）上样时,注射器不可过低,以防刺破胶体；也不可过高,样品下沉时易发生扩散，溢出加样孔。（5）剥胶时要小心,保持胶完好无损,染色要充分。（6）聚丙烯酰胺具有神经毒性，操作时要戴手套。,思考题:,1.SDS在该电泳方法中的作用是什么？2.在SDS-PAGE中TEMED和AP的作用?,浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。当样品液和浓缩胶选Tris/HCL缓冲液，电级液选Tris/甘氨酸。电泳开始后，HCL解离成氯离子，甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。蛋白质带负电荷，因此一起向正极移动，其中氯离子最快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居中。电泳开始时氯离子泳动率最大，超过蛋白，因此在后面形成低电导区，而电场强度与低电导区成反比，因而产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动，形成以稳定的界面，使蛋白聚集在移动界面附近，浓缩成一中间层,
