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1、,主讲,中药检验技术,我国新世纪中药发展战略 我国是中药的发源地，但近年来发展滞后，在国际中药市场上已落后于日本、韩国。我国新世纪中药发展战略旨在推进中药产业化、现代化进程，力争在这个世界各国竞相发展的朝阳产业领域抢占先机。,我国新世纪中药发展战略新世纪中药发展战略的要点：以创新为核心，加速中药现代化进程 以标准为重点，提高中药产品质量 面向市场，积极推进中药产业发展 加强中药资源保护 优势集成，共同推进中药现代化发展,我国新世纪中药发展战略以创新为核心，加速中药现代化进程。古老的中药产业当务之急是实现现代化，不能再一味依靠“祖传”，大胆创新才有出路。我国将继承和发挥中医药特色和优势，以创新为
2、核心，吸纳多种现代先进科学技术，包括信息技术、生物技术及植物药研发技术等先进技术手段，加强理论创新、技术创新及产品创新，加快创新平台建设，在创新中发展，在发展中创新。,我国新世纪中药发展战略 以标准为重点，提高中药产品质量。标准化程度不高，是中药走向国际市场的主要障碍。中药标准对于保证中药产品的安全有效、质量可控具有重要意义。目前，国际上还没有公认的中药标准。我国必须加快建立符合中药特点的、科学的、能为国际公认的现代中药标准。,我国新世纪中药发展战略面向市场，积极推进中药产业发展。中医药科技发展必须瞄准国内外需求，在保证中药疗效的前提下，改进中药传统剂型，提高质量控制水平，加快疗效确切、使用安
3、全、质量可控的中药新产品的开发，实现传统中药产业向现代中药产业的跨越。,我国新世纪中药发展战略 加强中药资源保护。近年来，生态恶化和资源破坏是威胁中药发展的重点因素。中药必须可持续发展战略。开发中医药的同时，必须注意资源及生态环境的保护，保障中药材资源的可持续利用，保障中药产业的可持续发展。而保障中医药产业的可持续发展，其根本出路在于科技进步。,我国新世纪中药发展战略 优势集成，共同推进中药现代化发展。政府通过制定国家战略目标、创造良好发展环境，宏观引导中药现代化发展的方向，集成高等院校、科研机构、制药企业等多方面力量，发挥区域优势，通过整体布局、资源重组、机制创新，构筑研发体系。棗中医中药相
4、互促进，协同发展。中医、中药密不可分。中药是在中医理论的指导下发挥其治疗、保健、康复等重要作用的。加强中医临床诊疗规律的研究，促进中医、中药协同发展。,目前中药材及中成药的检验方法有性状鉴别、显微鉴别、理化鉴别、色谱分析、光谱分析及其他仪器分析等技术。在继承传统经验鉴别的同时,积极开发应用新技术、新方法。实践证明,仪器分析枝术在中药检验工作中有广阔前途,逐步实现中药检验的规范化、现代化和科学化是完全可能的。,中药是中医防病治病的物质基础,是保征中医疗效的重要标志之定,中药的质量好坏,直接关系着亿万人民的身体健。但由于种种原因和历史条件所限制,再加上一些不法分子人为的伪造及掺假,致使中药较为复杂
5、、混乱,收假、收错、误用错种屡有发生。为保征人民用药安全有效,必须提高我们的中药检测水平,开展新技术的研究应用,适应新形势的发展的需要,根据不同情况,采用不同的检验方法和技术,作出正确的结论,供卫生行政部门处理。,中成药是祖国医药学宝贵遗产的重要组成部分,在国内外享有很高的信誉。实现中药评价的科学化和标准化有利于中医药走向世界 1。在新药的研制过程中,新药审批办法 2 中明确要求要制定临床研究用质量标准及生产用质量标准;目的是确保临 床研究用药品的稳定一致及上市药品的质量,从而保证药品的安全有效.质量标准伴随产品从始至终.3 加强中药新制剂的质量标准研究,使中成药制剂纳入规范化,势在必行,使祖
6、国医药走出国门,走向世界。,一、药品应具有安全性,有效性,稳定性及质量可控性。药品质量标准应反映上述性质。同时还必须具有权威性，科学性及当代研究水平 4;药品标准是国家宏观管理药品质量的手段之一。药品标准是保证人民用药安全与有效所必须，是必需遵循的法定依据。,一、药品应具有安全性,有效性,稳定性及质量可控性。精密仪器的不断发展给中药新制剂质量标准提供了先进的方法手段，如用气相色谱法、高效液相色谱法、色谱光谱计算机联用技术、薄层扫描法、核磁共振波谱法、超 临界流体色谱法等先进技术和设备来研究分析中药质量 在常规分析技术方面采用导数光谱分析多种成分，也用比色法、薄层层析紫外分光光度法；分析方法是新
7、、老技术，现代与传统方法并上。,一、药品应具有安全性,有效性,稳定性及质量可控性。我国对中药（包括药材和成药）的深入研究报道有每年递增的趋势，这表明中药质量的控 制和制订质量标准是势在必行的，并为之提供了有利的条件。目前许多质量标准尚停留在经验鉴别及简单的理化鉴别阶段,尤其是地方标准及保健品的质量标准,末能很好地控制药品的质量.质量标准测试都是在化学成分上,中成药质量标准仍然面临着如何制订高水平而又实际可行的质量标准内容问题。,一、药品应具有安全性,有效性,稳定性及质量可控性。而现行质量标准的严肃性又受到两方面的挑战，即由于部分标准本身欠完善，因此损害了它的权威形象；另外少数人质量意识很差，视
8、标准无物。,一、药品应具有安全性,有效性,稳定性及质量可控性。但中药成分十分复杂,中药制剂大多由中药药材粉末或浸膏制成，质量难控制，对有效成分定性或定量的干扰较大。且中药新制剂是在中医药理论指导下用药,通过各味产生的综合效能而达到治疗的目的,单用一两个化学成分是不能完全作为临床的评定指标的,建立在现代理化分析基础上的质量标准是一个控制标准，或者说是一个不完全的评定指标，这与化学药品不同,但通过这一质量标准起到了保证药品质量的控制作用。,一、药品应具有安全性,有效性,稳定性及质量可控性。同时，中药新制剂的质量标准的研究也能够完全保证在整个药效研究和临床研究过程中所提供样品的质量稳定性。中成药质量
9、标准,其目的在于起着控制产品质量的稳定性,要达到可控,就必须要求各项制定的内容切实，能充分反映出该制剂所含药品的真实性，剂型的稳定性及纯度和品质的优良度。但目前中成药还没一个切实可行的评价标准。,二、新药审批办法对中药新制剂质量标准的要求：中药新制剂的质量标准及其目的控制产品的终端。它必须在处方固定和原料质量、制备工艺稳定的前提下进行。其内容包括：名称（中文名）、汉语拼音名称、处方、制法、性状、鉴别、检查、含量测定、功能和主治、用法和用量、禁忌、注意、规格、贮藏、使用期限等项目，以及起草说明。,二、新药审批办法对中药新制剂质量标准的要求：新药审批办法中有关命名有明确的要求,中成药名称应是对该中
10、成药药物组成、药理作用和主治病症的概括,因此一个药品的名称是否恰当,有时会影响到人们对该药品的认识和接受程度。,二、新药审批办法对中药新制剂质量标准的要求：科学的命名则是中成药质量标准的重要组成部分。一个新药命名恰到好处时，能起到“命名效应”，事半功倍的收获 7。使名称顶向于作用与用途是主要的发展方向，但由于药品相同功能和疗效较多，应避免混同,二、新药审批办法对中药新制剂质量标准的要求：处方中各药味排列应根据中医药理论，按君、臣、佐、使的顺序排列。各组份（含辅料）应符合法定标准。如原料药材是多种来源时，应按实际使用的品种收入标准，品种存在有混乱情况，必须以具体品种收入标准。无法定标准的组分，要
11、另制定相应的标准 9。处方中药材用量一般控制成1000粒（或片、l等）。实际应用时，按折算投料。,二、新药审批办法对中药新制剂质量标准的要求：制法项应在保证质量的前提下，叙述处方各味药处理的简单工艺，使用药味，辅料的名称及用量，制成的剂型，制成品数量等。保密品种制法可略。但应提供可作为卫生检查结果判断依据的说明（如是否含生药粉及动物药味、防腐剂等）。目前许多保密品种提供，以致造成卫生学检查难于按规定下结论。,二、新药审批办法对中药新制剂质量标准的要求：性状包括成品的颜色、外形、气味。通常是除去包装及包衣或囊壳后的实际情况拟定。外用药不描述味。性状项的描述应是多批样品综合描述，且是在初步稳定性试
12、验和稳定性实验过程中的实际观察情况拟定，因此，规定应有一定的范围 9。如“安宫牛黄丸”规定为黄橙色至红褐色。,二、新药审批办法对中药新制剂质量标准的要求：中药制剂多为复方，鉴别的目的是为了确定该组份中药材的存在、真伪和纯度，或某一成分是否含有，复方制剂并非全部药味都要求鉴别，但方中君药，贵重药剧毒药应首选。所选择的鉴别药味应尽可能全，一般要求应占总药味的0以上 9。,二、新药审批办法对中药新制剂质量标准的要求：有成熟药味的鉴别方法应选上，鉴别方法按经验鉴别、显微鉴别，理化鉴别、色谱鉴别的顺序排列，所选用的方法要求既有专属性又应有先进性。,二、新药审批办法对中药新制剂质量标准的要求：（1）经验鉴
13、别，其方法包括形状、表面、颜色、气、味、水试、火试、水火共试等。如有许多中药材可用水试进行鉴别 10。但经验鉴别多已纳入性状项。在选择经验鉴别方法时，应注意使用任何人都能够简单地进行试验检查的方法。,二、新药审批办法对中药新制剂质量标准的要求：（2）显微鉴别，适用于含生药或部分生药粉末的制剂，中药新制的显微鉴别也是专属、快速、简便、准确的科学方法，有着可靠的实际应用价值。通过用显微镜来观察，择其具专属性组织特征，作为鉴别依据，从而判断组份有无、真伪，纯度，品质。例如有人总结出草酸钙结晶体在被子植物中的分布规律作为其鉴别依据。同时应用显微化学方法或微量升华显微法确定某些化学成分 12。,二、新药
14、审批办法对中药新制剂质量标准的要求：其步骤可分为：1、直接取样法；2、刮取法；3、研磨取样法；4、离心取样法；前两法应注意取样的代表性。对含量少或含有糖分较多和粘稠的样品，可采取加水离心清洗的办法，取沉淀物制片。显微待特征的观察应在三个以上批次的样品。每批次应不低于5张片。,二、新药审批办法对中药新制剂质量标准的要求：在起草说明中应绘制墨线详图，绘图应有粗细、比例或放大倍数。采用简图必须按规范的组织显微特征简图表示法 13。另外随着科学仪器的普及，将电子显微镜或扫描电子显微镜应用于中药新制剂的鉴定是可行的，尤其是在含有种子类中药的鉴别，扫描电镜可观察到某些细微特征予以鉴别,二、新药审批办法对中
15、药新制剂质量标准的要求：（3）理化鉴别是反映中药新制剂所含的有效成分或有效部位及其特征成分的理化性质，来鉴别真伪、纯度或存在。由于理化反应凡有相同功能团的成分，均可能呈正反应，因此专属性不强。主要在制定质量标准初期阶段作为成分预试筛选试验，不宜作为标准中的最终鉴别项目。,二、新药审批办法对中药新制剂质量标准的要求：理化鉴别应进行空白对照，经确实没有干扰，并有一定的专属性方可采用。处方中药味数较少时或含矿物药或提取物时，可尽可能多作理化鉴别。处方中有升华物时采用微量升华，在显微镜下观察结晶，再利用显色反应进行鉴别。对含多味药的新药制剂，不宜采用理化反应来进行鉴别。,二、新药审批办法对中药新制剂质
16、量标准的要求：因为各药味成分复杂，含有相同功能基团的成份较多，容易造成干扰。对于荧光鉴别时，如供试液点于滤纸上，置紫外光灯（365）或（254）下观察，所显的颜色判断，必须注意操 作的细节，在斑点末干及干后的斑点荧光颜色，往往有所不同；另外在喷以三氯化铝等试剂时，有时需要加热100烘后斑点颜色方可明显，因此，标准中应明确注明，否则将产生错误的判断结果。,二、新药审批办法对中药新制剂质量标准的要求：（4）色谱鉴别，色谱法的原理可概述为：当将样品混合物注于固定相上（或流路中），并由另一个流动相流过此固定相时，由于样品混合物中各组分在不同的两相中溶解、解析、吸附、脱附，或其它亲和作用性能的差异，当两
17、相作相对运动时，使各组分在两相中反复多次受到上述各作用力的不同而以不同的速度在固定相上移动，从而得到互相分离,二、新药审批办法对中药新制剂质量标准的要求：色谱法可分为多种，但在中药制剂色谱鉴别试验中，应用量多的是薄层色谱法（）。在中药制剂中，用薄层图谱与对照品（或对照药材）的图谱相比较，即可鉴别出有效成分或特征成分，尤其是有效成分尚不明确时，显微鉴别法不能使用时，更显示薄层色谱法的实用性及优越性。但薄层鉴别试验设计，必须注意目的性、针对性、重现性和准确性；因此要求比较严格，有所规定。,二、新药审批办法对中药新制剂质量标准的要求：由于样品多为复方，成分复杂，干扰成分较多，薄层鉴别要设阴性对照实验
18、，试验条件要经过优选，薄层色谱图应有多批样品均有重现性。影响薄层色谱的条件较多，样品在与对照品(提取物对照或对照药材)的薄层色谱图和阴性对照下，在同一板上得到证实时，才能作为判断标准。通过拍摄彩照可将薄层板所提供的全部信息（斑点）完整地以照片形式记录下来，从而得到永久性的指纹照片（薄层色谱图），以反映其真实性,二、新药审批办法对中药新制剂质量标准的要求：实验条件的展开剂选择应有三种以上均能 证明供试品中的欲鉴别成分与对照品的层析行为一致，再从中选取较好的一个条件列入质量标准正文中，其余展开方法写入说明中。在选用对照品(单体)进行薄层色谱鉴别时,确切地说其鉴别结果只能证明是否含某一成分,而不一定
19、能确证是否含某药材 17。,二、新药审批办法对中药新制剂质量标准的要求：当所检成分为制剂中数种药味所共有时,应选用药材对照品,因为其色谱图提供的“指纹谱”鉴别特征更多，专属性更强；如“牛黄上清丸”中黄连的TLC鉴别,用盐酸小檗碱对照品及黄连对照药材同时进行 8。但应选用地道药材作为对照品，对多种来源的药材，应对各种进行考察，找出共同的特征斑点作为鉴别依据。,二、新药审批办法对中药新制剂质量标准的要求：在选用对照药材时，从样品得到的色谱不一定与其它色谱完全一致，但主要斑点一致，以能够作出准确的判断；但正文中应写成样品的色谱图与对照药材的色谱图的主斑点一致；但中药成分复杂；明显主斑点有的较多，与对
20、照药材的明显斑点不完全一致，往往给判断结果带来困难；造成这一原因主要对照药材溶液的提取方法、纯化方法与样品供试液工艺、供试液制备方法不完全一致。,二、新药审批办法对中药新制剂质量标准的要求：因此，在设计薄层鉴别时应注意不同工艺和不同剂型的特点，应注意工艺是水煮提取还是醇提；对照药材溶液制备时应注意一致，否则，所得的供试品色谱与对照药材溶液品色谱图不一致或不完全一致的情况。,二、新药审批办法对中药新制剂质量标准的要求：有人提出对照药材溶液应“精提”，但中药成分复杂，对照品过于“精提”，有时会出现“假阳性”情况,即“指纹斑点”少，专属性差。因此，必须作阴性对照试验；阴性试验可以采用未加鉴别的药味来
21、进行；也可采用将所有药味均各按图中方法制成供试品溶液后点于同一薄层板上一齐展开；看其它药味有无干扰。但前法应用较多，可以避免各药味混合后产生反应所带来的“假阳性”结果。后法一般不采用；但作为质量标准制定时，为选择有鉴别特征药味的薄层色谱时，采用此方法将大为方便。,二、新药审批办法对中药新制剂质量标准的要求：影响薄层色谱分析的因素较多 19,20;重现性容易受影响；操作条件规范化尚待统一；环境因素如温度影响较大，因此薄层板、点样、展开、显色等都要符合规范化要求。,二、新药审批办法对中药新制剂质量标准的要求：规范化的要求包括：（I）仪器与材料；（II）操作技术及实验环境。此外,用于中(成)药鉴别的
22、方法还有:(1)薄层扫描法;(2)气相色谱法;(3)高效液相色谱法;(4)电泳法;(5)荧光法;(6)紫外分光光度法;(7)红外分光光度法等，但应用较少。,二、新药审批办法对中药新制剂质量标准的要求：检查 中成药制剂的通则检查,依照中国药典2000年附录有关规定，如果末能控制在通则项下的要求，则应在正文中另设检查限度，起草说明中列出具体数据及说明规定的理由，且致少应有10个批次20个数据指标的要求。,二、新药审批办法对中药新制剂质量标准的要求：含量测定 含量测定是质量标准的核心部分，含量测定是用现代理化分手段上测试药物所得到的结果。正确合理的控制标准，是提高质量标准可靠的关键所在。,二、新药审
23、批办法对中药新制剂质量标准的要求：含量测定的方案设计按新药审批办法的要求制订，选择处方中君药及臣药的有效成分做为含量测定指标。对君、臣药应予以高度重视，力求找到合理检测方法，否则就得不到质量保证；其次要对贵重药、毒剧药进行检测，以确保药效和用药安全,二、新药审批办法对中药新制剂质量标准的要求：新药审批还规定，如成品测定干扰较大难以测定时，应对其原料（药材）作含量控制，以间接控制成品质量。主要有效成分或特征成分不清楚时，以总有效成分的限量测定（如总皂甙、总黄酮、总生物碱等）。在含量测定确实无法建立时，可将浸出物测定作为质量控制项目，但必须具有针对性和控制质量的意义。,二、新药审批办法对中药新制剂
24、质量标准的要求：在选择某个有效成分进行含量测定时。应充分了解该成分的性质，因为中药新制剂多为复方，各药味混合后各成分之间会发生转化或变化；如含苦参碱类成分的药味在煎煮 或与还原性化合物的药味存在时，均会发生转化，氧化苦参碱的含量减少，而苦参碱的含量曾加 21,22；我们在进行“白山片”质量标谁研究时，曾发生上述情况，本品为含有山豆根的复方制剂，因此用氧化苦参碱的含量来反映山豆根的质量 23;在测定时应特别注意其不稳定性及提取条件的选定,二、新药审批办法对中药新制剂质量标准的要求：随着科学技术的不断发展，新的检测手断不断完善，测定中成药有效成分含量的方法手段越来越先进，但每种含量测定方法，则必须
25、进行方法学考察试验。含量测定方法不同，要求含量测定方法学的考察试验内容也有所不同。,二、新药审批办法对中药新制剂质量标准的要求：如薄层扫描方法学考察试验包括：（1）待测斑点与对照品的一致性和分离度；（2）工作曲线；（3）精密度考察；（4）回收率试验；（5）稳定性考察；（6）检出限度考察；（7）测定结果的计算与数据的统计检验。,二、新药审批办法对中药新制剂质量标准的要求：高效液相色谱法的考察试验内容包括：（）色谱条件；（）样品前处理；（3）含量测定方法；（4）阴性对照试验；（5）回收率试验；（6）重现性试验；（7）含量限度指标的确定。,二、新药审批办法对中药新制剂质量标准的要求：测定中成药含量的
26、方法很多，应根据具体情况加以选择；如用薄层层析比色法（或紫外分光光度法）测定含量的中成药有：六味地黄丸,小儿奇应丸,藿香正气水等;用薄层扫描法测定含量的有:六味地黄丸,小儿奇应丸,三黄片等;用气相色谱法测定含量的有:桑菊感冒片,六神丸,冰硼散等;用高效液相色谱法测定含量的有:乌鸡白凤丸,枫蓼肠胃康冲剂,银杏叶片等;用原子吸收光谱法测定含量的有:护肝片,陈香露白露片等。,三、现阶段的质量标准研究 多限于检测其主要药效成分;控制指标而且停留于改进和建立方法方面。而日本对中成药质量管理,要求含量测定最少应有两种以上的成分即“指标物质”作含量；如含厚朴中成药中厚朴酚及和厚朴酚的同时定量 36；含知母中
27、成药中的知母皂甙B-II，知母皂甙A-III 及芒果素的HPLC测定 37。,三、现阶段的质量标准研究随着中医药药效学和化学研究的新进展，如何进一步运用多种检测手段，建立检测中成药中能反映中医疗效的药效成分的质量控制指标,尤其是加强在与药效有密切相关的微量元素 38 及与毒性相关的农药残留物的检测控制方面的研究。是深入研究传统中成药质量的重要方面,也是祖国医药学走向世界的重要保证。,目前我们常用的中药检验技术 一、基源鉴别 二、性状鉴别 三、显微鉴定 四、理化鉴别反应 五、色谱分析 六、光谱分析 七、其他,一、基源鉴别:就是应用植(动)物的分类学知识,对中药的来源进行鉴定,确定其正确的学名,以
28、保证应用的品种准确无误1、2。对原植物的鉴定步骤如下:首先观察植物形态对活的或比较完整的标本要注意标本的完整性,代表性,对植物标本特别注意繁殖器官,如标本不完整,无代表性,除对极个别品种的特征十分突出可以鉴定外,一般都要追究其原植物,包括深入到产地调查,采集实物标本,否则无法入手鉴定。根据已观察到的形态特征,核对资料,结合鉴定人的分类经验,能初步确定科属的,直接可查该科属的资料;若对科属都不能确定的,就必须查植物分科检索表。当知道末知物是什么科属时,可以到标本室核对已定学名的该科标本,或根据已知文献核对已定学名的某种标本。动物药材的鉴定也基本同上。,二、性状鉴别 由于各种药材来源不同,性状上就
29、有一定的特 异点,性状鉴别就针对这些特异点,对药材的形、色、气、味、大小、质地、断面等特征,通过眼看、手摸、鼻闻、口尝、水试、火试等简单方法,直接感观药材,作出符合实际的判断。尤其是老药工的传统经验,更值得学习。但这是直观鉴别,有一定的狭隘性和局限性,所以,必须开展新枝术的研究用。,三、显微鉴定 显微鉴定是简捷可靠的中药品种鉴定手段之一3、4、5。通过对中药材的细胞组织及其内含物的形态特征和理化检测,植物器官等各部位的典型和异常的结构,各类动物解剖构造和组织特点的光学鉴定常数等显微特征,以对中药材的真伪作出正确的判断。尤其是对中国传统中成药,如用其中药材粉末制成的膏、丹、丸、散之类制剂,原有的
30、外表特征都已消失,用肉眼难于鉴别其真伪,即所谓“膏丹丸散,神仙难辨”的说法。而实际上,在处方工艺相对稳定的情况下,可以在显微镜下,观察药材粉末显微组织,根据其细胞的形态学特征,各种内含物或其它微细特征加以鉴别,达到准确鉴别的目的。随着显微技术的发展,偏光显微镜,荧光显微镜,紫外光显微镜,显微摄影技术等在中药检验鉴定方面都得到迅速的应用。,三、显微鉴定 20世纪30年代,出现电子显微镜,它并非光学显微镜,但基本结构与光学显微镜相似,所不同的是用电子流代替照明的光线,用电子源代替了光源,以及用特殊的电极或磁板(静电透镜或电磁透镜)代替了光学显微镜的集光器,物镜和目镜的作用。它的分辨率比光学显微镜提
31、高8万倍,从此生物学入超微时代。但是,供电子显微镜需要用超薄切片机进行切片,标本厚为0.020.1微米。1938年出现了扫描电镜,它放大范围广,可以方便地从10倍到20万倍作连续扫描,分辨率更高,景深大,样品不用切成薄片,35毫米厚的材料可直接放入观察,它特别适合孢子、花粉、叶、花、种子、果实及其他薄片或粉末状材料表面构造的分析鉴定。最近有人应用电子显微镜对海水珍珠和淡水珍珠研究发现断层结构有差异,解决了两者鉴别上的难题。,四、理化鉴别反应 每种中药都含有一定成分,这些成分,尤其是活性成分,常能代表某些中药的内在质量。理化检验就是利用中药中存在的某些化学成分的性质,通过物理方法或化学反应(为便
32、于说明问题,仪器分析另分开讨论),来鉴定中药的真伪的质量。随着植化研究工作的发展,6070年代,中药质量标准采用理化反应几乎成常规并在不断提高、完善。但它也存在缺点,就化学鉴别有些只往往是鉴别某一类物质(成分、化合物),专属性较差,因此,后来许多鉴别反应就逐步被薄层色谱所代替。,五、色谱分析 自从1906年茨维特成功利用吸附柱分离色素以来,色谱技术迅速发展,目前主要应用于药品检验上的色谱技术有:1、薄层色谱法 2、高效层色谱法:简称HPTLC 3、热馏薄层色谱法:简称TAS 4、薄层扫描法:简称TLCS 5、气相色谱法:简称GC 6、高效液相色谱法:简称HPLC,1、薄层色谱法 薄层色谱法简称
33、TLC,是Kirchner等人在五十年代从经典柱层析及纸层析的基础上发展起来的一种色谱技术6,是目前中药检验的最常用的鉴别方法,与薄层扫描仪联合应用,不可以进行含量测定。TLC具有设备简单,操作方便,分离快速,灵敏度高,分辨率高,专属性好的特点,显色剂选择性大,以及制备薄层载量大,而切割色谱方便等优点,因此,在分离分析及少量制备工作中基本取代了纸层析及柱层析。由于TLC鉴别是考察药品真实性的有效而简单的手段之一,尤以对成分复杂的中药有重要意义,比如,以前对熊胆与用其他胆汁伪造的伪熊胆,西洋参与用国产生晒参伪制的伪西洋参,以前用理化方法就很难加以鉴别,后来在广卅市药检所谢培山老师的努力下,终于用
34、TLC法解决了 7、8。现在,TLC已成为各级药品检验所,各药材公司及中药厂的质检常规或强制性检测手段。,1、薄层色谱法 TLC技术的应用近年来发展迅猛,仪器设备,技术水平不断提高,科学化,现代化,自动化及规范化正在不断普及。广卅市药品检验所谢培山老师主编的中国药典中药薄层色谱彩色图集已成为从事中药检验工作的TLC鉴定的重要工具书9,刘训红主编出版的中药薄层色谱鉴别等许多有关TLC的资料10、11、12,给我们提供了必不可少的参考资料。,2、高效层色谱法:简称HPTLC HPTLC是在普通薄层基础上发展起来的一种更灵敏、更精细的薄层技术13。与TLC不同主要在于HPTLC改进吸附剂更细,更匀(
35、粒度57微米),因此提高了分离率(比普通薄层高三倍),增加检出灵敏度,使斑点小圆,重现性增强,同时,点样量减少在0.1微升以下,使原点控制在1毫米内,展开时间缩短,展距缩小,达到微量,快速,高效目的。,3、热馏薄层色谱法:简称TAS TAS是将微量样品粉末510毫克,装入耐热玻璃管中,管底部用垫封闭,管壁用可调试金属加热,药材受热后挥发物质随含水分子筛的水蒸气经玻璃棉过滤后从毛细管逸出,点样薄层板上,再用普通层析法层开。本法具有微量,自动的优点,但目前实际检验中还极少应用。,4、薄层扫描法:简称TLCS 以上所说的三种色谱法,都为定性鉴别用,而要定量常常需要将斑点洗脱,再用化学分析或仪器分析方
36、法作定量测定。手工洗脱不但费时,而且损失较大,定量误差也较大。1972年,日本岛津公司首先推出CS-900型薄层扫描仪(又称薄层光密度计),用这种仪器对薄层上被分离的物质(斑点)进行直接定量,就叫“薄层扫描法”。它的基本原理是采用一束长宽可以调节的一定波长,在一定强度的光,照射到被测薄层板的斑点上,进行斑点扫描(包括有紫外吸收的无色斑点),利用仪器测量通过斑点时光束强度的变化,而达到定性定量的目的。,4、薄层扫描法:简称TLCS TLCS仪已进入分离高效化,定量仪嚣化,数据处理自动化的阶段,尤其在中成药检测方面的含量测定应用较多,如中国药典收载的六味地黄丸含量测定等均应用此法测定含量14,许多
37、专著及资料都已作大量报导 15、16、17、18。一些中药虽所含成分相同,用TLC鉴别有时不直观,而用TLCS则很直观,如目前一不法分子用人工引流熊胆充天然熊胆,用TLCS测定出熊去氧胆酸和鹅去氧胆酸的含量,如果熊去氧胆酸比鹅去氧胆酸的含量高,便是天然熊胆,否则是人工引流熊胆19。,5、气相色谱法:简称GC 本法是采用气体作流动相(称载气),色谱柱内装有吸附剂,高分子多孔小球或涂有固定液的载体。注入进样口的供试品被加热气化,被载气带入色谱柱内分离后,各成分先后进入检测器,用记录仪记录色谱图,从而进行定性和定量。目前本方法主要用于含挥发性成分的中药定性和定量,许多含挥发性药材及制剂,尤其进口药油
38、类的检测多都是采用本法定性定量 20、21、22。另外,有些很难鉴别的混淆品,如各种砂仁,可以应用气相色谱/质谱分析研究,作为鉴定依据23。但本法对不能气化的样品,无挥发性的盐类及许多无机物,则无能为力。,6、高效液相色谱法:简称HPLC 本法是将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲剂等作为流动相,用泵将流动相压入装有填充剂的色谱柱,注入供试品,经流动相带入柱内,用记录仪记录色谱图,从而达到定性及定量的目的。本法应用范围比气相色谱广,只要样品能制成溶液,就可进行分析,尤其是中药的含量测定,更为适用。,6、高效液相色谱法:简称HPLC 由于卫生部要求,申报新中药时质量标准必须有一项以
39、上含量测定,否则不以批准。为此,申报单位、科研及药检部门投入大量时间、人力、物力及财力加以研究,其中,近年来高效液相用于含量测定最为突出,用高效液相作含量测定,具有分离效率高,快速,仪器化等优点,中国药典1985年版一部就开始收载此法,中药质量标准中用高效液相色谱法测定含量的资料就更多,如用反相高效液色谱法测定五味清浊散中胡椒碱含量24、高效液相色谱法测定鼻炎胶囊中葛根素的含量25 等等。,六、光谱分析 1、紫外分光光度法:简称UV 2、红外分光光度法:简称IR,1、紫外分光光度法 紫外光照射某些物质后,引起物质内部分子、电子或原子核间的运动变化,消耗一部分能量,然后透射出来,再通过梭镜,可得
40、到一组不连续光谱,根据光谱特征,如峰或谷的波长位置、数目、峰形、峰高等结合,对中药进行定性及定量。虽然中药成分复杂,但大多数中药成分中含有共轭双健结构的成分,可产生紫外吸收,其光谱有一定的特异性,从而,为中药鉴定提供了很有价值的光谱信息,借此判断中药的真伪优劣。,1、紫外分光光度法 随着仪器的普及,紫外分光光度法在中药检验中得到广泛的应用,四川省医药学校科研所等承担的“药材紫外光谱鉴别研究”课题,1991年10月19日在成都通过专家鉴定。该研究采用全息特征的鉴别方法,将峰数、峰位、谷数、谷位、肩峰、相邻峰高比值等可资利用的鉴别参数,都用于进行鉴别,并将这些参数输入电子计算机进行数据库的微机处理
41、。据测定出200组533种药材及其混淆品在水、乙醇及环已烷三种不同溶剂中的紫外吸收曲线1599条,结果表明,绝大多数药材可以利用紫外光谱进行鉴别。,1、紫外分光光度法 如西红花的掺伪品有菊科红花、有用西红花的非药用部分加工而成、有各种植物部位加工制成品,虽然外观很像,但其甲醇提液,照分光光度测定其吸收度,结果表明在458 1nm和432 1nm波长处有最大吸收,同时吸收度458nm与432nm的比值为0.840.90之间,而其他伪品或非药用部位的吸收曲线与西红花完全不同,为此可以用本法鉴别西红花的真伪26。真龙心丹中的西红花也是应用紫外法进行鉴别的27、28。,2、红外分光光度法 物质分子在红
42、外线照射下,当红外线一定波长的光能与分子各种运动能级相同时,就能吸收光能产生共振,于是产生对红外线的选择吸收,因此呈现出相应的红外吸收光谱。通常一般的中药检验用红外分光光度法鉴定真伪不多,主要用于推断物质分子结构。,2、红外分光光度法 广西药检所曾应用红外分光光度法对牛黄真伪进行研究,在17001550cm-1范围内,天然牛黄有三个较强的特征吸收倒峰,A1663 9cm-1;B1628 4cm-1;C1566 10-1,因牛黄系混合物,其化学组成及各成分含量上不尽相同,故特征吸收峰位波动范围稍大,但多次实验表明,仍具有稳定的鉴别意义29。还有报道对大黄及其伪品、厚扑及其伪品、西洋参及其伪品(人
43、参)、白芍和赤芍的红外光谱进行研究2。,七、其他 除上述中药最常用的检验技术和方法外,色谱分析还有离子交换法,凝胶薄层色谱法,等电点聚焦薄层色谱法。光谱分析还有荧光分析法。此外还有液滴逆流技术、同步扫描技术、离子选择电极的应用、生物检定技术(如洋地黄的含量测定30)、电泳法(如对阿胶和蛤蚧的研究2)等等。,我国药典的重大修改 我国将对国家药品标准的主体中国药典从六个方面进行重大修改。修改后的中国药典将突出中药的标准化和现代化，成为我国药典发展的一个里程碑。,我国药典的重大修改首先要扩大和调整收载中药品种及常用中药制剂辅料 规范试验方法和试验条件 增加和完善中药质量标准安全性指标 加强中药检验方
44、法的专属性，提高中药质量标准的可控性 积极采用现代科学分析技术，增强先进性和可操作性 建立符合中医药特色的质量标准体系，逐步由指标性成份向活性成份的测定过渡,我国药典的重大修改中国药典是国家药品标准的主体，被誉为中药界的“宪法”。据钱先生介绍，中国药典中药质量标准的发展为三个阶段。53年版和年版为中国药典第一阶段 年再版的中国药典为第二阶段 年至年版的四版是第三个阶段,我国药典的重大修改年版和年版为中国药典第一阶段。年版中药质量标准基本参考国外药典制定，但品种只收载了大黄等几十种国际通用生药，无专属性鉴别，缺定量指标。年版的中药部分为体现中药特色，增改了炮制、性味、功能与主治、用法与用量等内容
45、，并增加了鉴别项。但是受当时科技水平的局限，仍处于靠外观形态的经验鉴别阶段。,我国药典的重大修改年再版的中国药典为第二阶段。此次再版的中国药典在中药质量标准中大量收载了显微鉴别，尤其是粉末显微鉴别。这对于过去的单以外观形态的经验鉴别进了一大步。是中国药典的第一次大的飞跃。,我国药典的重大修改年至年版的四版是第三个阶段。由于科技的进步，中药由手工生产向向工业化大生产过渡，其产品质量必然要实现由经验控制向科学控制转变。因此，中国药典从年开始正式将薄层色谱用于药典中药质量的控制，结束了中药无专属性鉴别的历史。年版的药典设直了薄层色谱鉴别对照药材，既体现了中药的专属性、又体现了整体，较单一的化学对照品
46、鉴别更有效。同时，首次引进用现代仪器检测方法测定含量。年版改用高效液相色谱法解决了专属性测定问题，准确科学性都得到了明显提高。,我国药典的重大修改首先要扩大和调整收载中药品种及常用中药制剂辅料。钱先生说，目前中国药典收载中药材种，中成药种，共计种。但所改集的中药材和中成药与中医临床用药的数量相比，有相当大的缺口，不适应现代疾病谱的变化。因此，年版的药典目标之一就是扩大收载中成药品种，使之基本涵盖中医临床各科中药范围。同时，对中药材和中药饮片也要扩大收载量，以适应药品生产、检验及监督管理的需要。,我国药典的重大修改规范试验方法和试验条件是再版药典的另一项重要工作。这位专家介绍，在目前的药典中，许
47、多试验方法和条件尚有许多亟待规范的地方。比如，薄层色谱法，它是一种使用频度相当高的方法，但在目前的药典中对这一方法缺少科学的细致的规范。年再版药典将不再允许用手工辅的薄层板，而要用标准化，并将对药典收载的个薄层鉴别在统一规范的条件下重新试验，建立对照薄层色谱图。,我国药典的重大修改增加和完善中药质量标准安全性指标是又一重点。钱先生介绍说，主要有两类，一类是由污染带进来的，如残留的农药、重金属、杂质、微生物、黄曲霉毒素等。另一类是自身有的一些毒性中药，除国务院公布的种外，还有近年来发现的马兜铃酸等等。,我国药典的重大修改加强中药检验方法的专属性，提高中药质量标准的可控性是再版的一个内容。他说，过去常用的理化反应，不能反应中药这个复杂化学成份体系中的真实情况，尤其对复方中成药更无参考价值，再版的药典都要改为专属性的方法。,我国药典的重大修改积极采用现代科学分析技术，增强先进性和可操作性。现代科学技术的发展，已经打破了过去“丸、散、膏、丹，神仙难辨”的困境，现代仪器分析技术，帮助中医药界提高了分析手段，所以在不脱离中国国情的情况下，此次修改，要加大仪器分析的比重。,我国药典的重大修改建立符合中医药特色的质量标准体系，逐步由指标性成份向活性成份的测定过渡，由单一成份向多个成份测定和指纹图谱整体控制模式的转化是又一重要内容。,
