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1、仔猪副伤寒活疫苗（C500株）生产操作细则,2012年11月,本品系使用免疫原性良好的猪霍乱沙门氏菌弱毒株，接种适宜培养基培养，收获培养物加入适当稳定剂，经真空冷冻干燥制成。本品用于预防仔猪副伤寒活疫苗。,1、菌种1.1疫苗生产用菌种为猪霍乱沙门氏菌C500弱毒株，原种购于中国兽药检查所，经扩繁后由质检部鉴定、保管、供应。1.2菌种标准1.2.1 C500弱毒株应符合以下标准1.2.1.1 形态和生化特性 本菌为革兰氏阴性小杆菌，生化特性应符合细菌分类学中本菌的特性。,1.2.1.2 培养特性 在普通琼脂平板上，37培养18-22小时，菌落为圆形、边缘整齐、突起、半透明、略湿润的光滑型。1.2
2、.1.3 血清学特性 普通琼脂新鲜培养物用玻片凝集检查法，对沙门氏菌属O7因子血清出现凝集反应。,1.2.1.4 特异性 在含1%的醋酸铊的普通肉汤中呈均匀浑浊生长，用新鲜普通琼脂培养物与0.2%吖啶黄溶液做玻片凝集试验应不出现凝集反应。1.2.1.5 安全性 用的普通肉汤或蛋白胨水，将培养24-48小时的普通琼脂斜面培养物洗下并作活菌计数，注射下列动物应符合标准。,小白鼠 18-22g（30-35日龄）的小白鼠10只，各皮下注射0.2ml，含活菌数1亿，观察21日，至少应存活9只。家兔 体重的家兔5只，各皮下注射1ml，含活菌数100亿，观察21日应存活。仔猪 用体重15kg以上的健康易感断
3、奶仔猪4头，各静脉注射1ml，含活菌数30亿，观察1个月应存活。,1.3 冻干菌种2-8保存期为10年。2、疫苗制造及半成品检验2.1 生产用菌种的制备2.1.1 一级种子繁殖和鉴定 冻干种子用普通肉汤稀释或经普通肉汤后，接种普通琼脂平板，37培养18-20小时，观察菌落形态，菌落为圆形、边缘整齐、突起、半透明、略湿润的光滑型。,选取中等偏大的菌落5-10个，混合后接种于普通琼脂斜面若干只，37培养24小时，经纯粹检验合格，并用0.2%吖啶黄溶液做玻片凝集试验应合格，作为一级种子。在2-8保存期不超过1个月，在此期间可以移植1-2次，在培养基上继代不超过5代。,2.1.2 二级种子繁殖 取一级
4、种子接种于普通琼脂或普通肉汤，37培养24小时，经纯粹检验合格后，即可作为生产种子，在2-8保存期不超过2日。,2.2 制苗用培养基制备 2.2.1 材料牛肉 要求应采购新鲜的精牛肉，3-5岁，前后腿、胸部，尽量少含脂肪、肌腱、筋膜等。鱼蛋白胨 1.5%胰蛋白胨 0.5%氯化钠 0.5%氢氧化钠水,制备方法 将新鲜的精牛肉去掉脂肪、筋膜等绞碎，纯化水低温浸泡24小时，100煮沸2小时，补足失去的水分，冷却静止沉淀24小时，抽取上清液，加入鱼蛋白胨、胰蛋白胨、氯化钠溶化，用氢氧化钠溶液调整pH值至7.8，煮沸20分钟，降温静止沉淀。,3.1条件准备3.1.1 根据菌液制备所需物品及设备条件，进行
5、全面准备。3.1.2 按使用时间，提前做好对发酵罐空消工作，包括罐体、空气过滤系统、各个进出料口，确保灭菌无死角。将准备好的各种物品提前移入洁净工作间待用。在工作开始前3040min，按净化级别要求调整送风量，达到洁净级别要求。提前一天对发酵罐进行全面灭菌，并保持发酵罐正压。,3.2 进料及培养基灭菌 将配制好的培养基通过管道打入发酵罐，加入消泡剂（猪油），然后对进料管道进行清洗、灭菌，关闭进料阀门，对培养基及所有的进出口、空气过滤系统进行灭菌，当温度达到90和100时，分别经上面空气进管和下面放料口向罐内通入蒸汽1分钟左右，罐内116保持40分钟，其他位置121保持40分钟。,灭菌结束后马上
6、夹层通冷水进行降温并及时补充无菌空气保持罐内正压。当温度降至40时，关闭冷水管道停止降温，通无菌空气保持罐内正压，打开自动控温系统的阀门和开关，温度控制在37。,3.3 接种在火焰保护下，连接种子瓶和发酵罐接种口，打开发酵罐出气阀关小发酵罐进气阀使罐内压力接近于0，确认无误后打开接种阀门，利用正压空气将二级种子按1%-2%的接种量接种于普通肉汤中，然后按2.5%加入40%灭菌葡萄糖溶液。,3.4 发酵培养接种后先小气量通入无菌空气2h，然后逐渐加大通气量，每2h增加通气量，培养后期每小时测定一次pH，当pH上升到7.8时加入40%葡萄糖溶液2000ml调整pH，培养1820小时，当菌数将要达到
7、最高峰时停止培养收获菌液，将菌液放入灭菌大玻璃瓶中。,4、配苗将事先准备好的冻干保护剂加入收苗瓶中摇匀，保护剂和菌液的比例是1:7，明胶和蔗糖的最终含量分别是1.3%和5%。配苗完成后马上进行分装和冻干。,注意事项：1、培养基是菌苗生产的关键，一定要把握好原材料的质量。2、发酵罐灭菌时，应注意千万不要留有死角，通气管道压力应高于罐内压力，不要造成培养基倒吸入空气过滤器。3、通气培养时应认真仔细，10小时后每小时要测定pH值，根据pH值的变化加入适量的葡萄糖溶液。4、注意无菌操作，生产种子应进行纯粹检验，接种、补料应尽量采用管道连接而不采用开口方式进行操作。5、合理掌握收苗时间，提高冻干菌存率。,
