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1、第七章 优良菌种的选育,授课教师：贺立虎,理想的工业发酵菌种应符合以下要求：,遗传性状稳定；生长速度快，不易被噬菌体等异种微生物污染；目标产物的产量尽可能接近理论转化率；目标产物最好能分泌到细胞外，以降低产物抑制并利于分离；尽可能减少产物类似物的产量，以提高目标产物的产量并利于分离；培养基成分简单、来源广、价格低廉；对温度、pH、离子强度、剪切力等环境因素不敏感；对溶氧的要求低，便于培养及降低能耗。,菌种选育，就是利用微生物遗传变异的特性，采用各种手段，改变菌种的遗传性状，经筛选获得新的适合生产的菌株，以稳定提高抗生素生产或得到新的抗生素产品。任何抗生素要不断提高生产水平，菌种选育是一重要手段
2、，一些高产菌株在传代和保藏过程中，不可避免地会逐步发生退化，这也需要通过菌种选育来复壮菌种 菌种选育常用的方法有：菌种的自然选育、诱变育种、菌种的基因重组。,第一节 微生物的遗传和变异,微生物是研究现代遗传学和其它许多主要的生物学基本理论问题中最热衷的研究对象。对微生物遗传规律的深入研究，不仅促进了现代分子生物学和生物工程学的发展，而且为育种工作提供了丰富的理论基础，促使育种工作从不自觉到自觉、从低效到高效、从随机到定向、从近缘杂交到远缘杂交的方向发展。,研究微生物遗传学的意义,一、遗传与变异的概念,遗传和变异是生物体的最本质的属性之一。遗传(heredity)：亲代生物的性状在子代得到表现；
3、亲代生物传递给子代一套实现与其相同形状的遗传信息。特点：具稳定性。遗传型（genotype）：又称基因型，指某一生物个体所含有的全部基因的总和；-是一种内在可能性或潜力。遗传型+环境条件 表型表型（phenotype）：指生物体所具有的一切外表特征和内在特性的总和;-是一种现实存在，是具一定遗传型的生物在一定条件下所表现出的具体性状。,变异(variation):生物体在外因或内因的作用下，遗传物质的结构或数量发生改变。变异的特点：a.在群体中以极低的几率出现（一般为10-610-10）；b.形状变化的幅度大；c.变化后形成的新性状是稳定的，可遗传的。,遗传与变异的概念,饰变（modifica
4、tion）：指不涉及遗传物质结构改变而只发生在转录、转译水平上的表型变化。特点是：a.几乎整个群体中的每一个个体都发生同样的变化；b.性状变化的幅度小；c.因遗传物质不变，故饰变是不遗传的。引起饰变的因素消失后，表型即可恢复。例如：粘质沙雷氏菌：在25下培养，产生深红色的灵杆菌素；在37下培养，不产生色素；如果重新将温度降到25，又恢复产色素的能力。,遗传与变异的概念,二、遗传变异的物质基础,1.遗传基因 早在1865年，遗传学的鼻祖孟德尔用豌豆做遗传学试验，得出了重要的遗传学规律著名的分离定律和自由组合定律，揭示了遗传的本质：性状是由遗传因子决定的，性状的遗传是由于。遗传因子在子代和亲代间的
5、传递。孟德尔的遗传因子后人改称为遗传基因。孟德尔的分离定律和自由组合定律，就是成对基因在杂合状态中保持相对独立性，在形成配子时，成对基因彼此分开，分离到不同的配子中去，两种配子数相等，配子的结合随机；两对或多对基因形成的配子，是自由组合的。,2.基因的物质基础 孟德尔不仅发现基因是生物体遗传的基本单位，并认定基因是由生殖细胞来传递的。当细胞核中的染色体被发现以后，人们认识到基因的传递规律和细胞分裂时染色体的行为是一致的。1910年摩尔根用果蝇进行的遗传学实验证实了基因在染色体上，进而把基因和染色体联系了起来。1928年格里费斯的转化实验证明了染色体的化学成分脱氧核糖核酸(DNA)是遗传物质。后
6、来在病毒重建实验和噬菌体感染实验中又进一步证明绝大多数生物的遗传物质都是DNA，只有一小部分病毒(包括动物、植物病毒和噬菌体)没有DNA，它们的遗传物质是核糖核酸(RNA)。,第二节 菌种复壮与自然选育,在微生物的遗传与变异这对矛盾中，遗传是相对的，而变异是绝对的。抗生素产生菌的变异主要是负变异，其表现为：a.产量低，b.产孢子能力减退，c.菌落形态不纯，d.存活能力下降，e.产色素能力改变，f.代谢活动减慢，g.抵抗不良环境能力减弱 这些变异是自然发生的不定向的、缓慢进行的，是一个由量变到质变的过程,生产中把变异细胞在群体中尚未占主导的现象称为退化现象.把变异细胞在群体中已占主导地位的现象称
7、为变异现象 当群体中出现变异现象时，则要把群体中的大量变异细胞除掉，只留下少数优良细胞进行培育，这种操作叫做自然选育.,菌种的复壮（rejuvenation）：使衰退的菌种恢复原来优良性状。狭义的复壮是指在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和生产性能测定等方法，从衰退的群体中找出未衰退的个体，以达到恢复该菌原有典型性状的措施；广义的复壮是指在菌种的生产性能未衰退前就有意识的经常、进行纯种的分离和生产性能测定工作，以期菌种的生产性能逐步提高。实际上是利用自发突变（正变）不断地从生产中选种,菌种的复壮措施：纯种分离：（平板划线法、涂布法、倾注法、单细胞挑取法等）。通过寄主体内生长进行复壮（如Ba
8、cillus huringiensis的复壮）；淘汰已衰退的个体（采用比较激烈的理化条件进行处理，以杀死生命力较差的已衰退个体）。采用有效的菌种保藏方法。,纯化分离的方法,1.单孢子分离 微生物群体中存在不同类型菌落的组成，并认为是由一些亚种混合组成的。其原因是遗传基因型与环境因素共同作用的结果。因此，不可能得到绝对纯一的菌种。但通过选择可以得到相对纯一的群体。,纯种的标准有两条：一是群体中存在的不同菌落类型数量限制在相对低的水平，例如限制在35种类型以下。二是群体中起主导作用的菌型的比例数应占绝对优势，如达到90以上，或更高的比例，如98、99以上。菌种经群体分离后证明达到以上两条标准即可认
9、为是获得了纯株。,任何一种微生物群体中都有占主要比例的菌落类型。这一主要类型的生理生化性状，包括产量的高低，便大体上决定了该菌株的特性。以“纯种”这一目标选育菌种，主要应该是提高微生物群体中主要菌型的百分比，选择主型菌落在90以上的纯株。同时辅以产量指标的选择。,单孢子分离法:将菌种的分生孢子制成一定浓度的分散的单孢子悬浮液，分离在平板培养基上，挑选单菌落进行筛选。在产量高于亲株的菌株中选择群体中主要菌落类型比例高于90以上的高产量纯株再进行35代连续传代试验，选择传代后生产能力仍保持原来水平范围的菌株，便是高产纯种。,2.微观单孢子分离 用单孢子悬浮液分离单孢子菌落的方法很难保证获得绝对的单
10、孢子菌落。因为在菌落生长过程中缺乏一道检查，检查每个菌落是否由单个孢子生长而成。如果单菌落不是由单个孢子长成，而是由一个以上的孢子甚至孢子团长成，那么就难以保证菌落的纯一。微观单孢子分离可以排除这个弊病，获得真正单个孢子生长形成的单菌落，以利选育得到纯一菌株。,微观单孢子分离的方法:在显微镜下，借助显微操纵器挑取单个发芽孢子，将每个单孢子都单独培养成单菌落。此法可确保单菌落由单个孢子发育形成。排除两个或多个孢子形成单菌落的干扰，为获得纯一菌株打下基础。,挑取单孢子的方法:用直径为2mm的细玻璃捧拉成具有120钝角玻璃丝的挑针，在显微镜下，借助显微镜操纵器，挑取单个发芽孢子。挑针的玻璃丝长度要求
11、不超过5mm。不能人工切断，要求拉成不足5mm长，以求针的光滑而不致伤害芽管。单个发芽孢子的制备是用斜面孢子或其它形式的固体孢子先制成单孢子悬液，在液体培养基中振荡培养1618h，使孢子发芽，以长成芽管为度。芽管的长度以不超过孢子直径为宜。因为芽管过短，不易上针，芽管过长，则容易缠在挑针上，不易下来.为了使孢子发芽适度，必须使用稀释的液体培养基。培养基浓度不要太大，避免养分过于丰富而控制不住孢子的生长。,孢子的发芽培养时必须控制较低的温度。常用的培养温度为1618，目的是延缓孢子的生长发育，控制其发芽使产生适度的芽管。然后用毛细管将发芽适度的单孢子液滴在盖玻片上，在不远处再滴上空白液体培养基。
12、此盖玻片覆盖在特制的玻璃小室上。玻璃小室为高约10mm的玻璃圆环，可使挑针伸入。在显微镜下找到单个的发芽孢子后，将挑针移入该孢子的右侧慢慢上抬。靠挑针进入液体时的振动，发芽的单孢子便吸到挑针上，挑上发芽孢子后，便将挑针慢慢下移，移至空白培养基液滴中放入。当挑针插入液滴时，针上的发芽孢子便借针入液体时的振动而离开挑针进入培养液中。用显微镜检查液滴中是否有移入的发芽孢子，同时检查是否是单个孢子。在确证已挑上单个孢子后，则将剩余的孢子液滴用酒精棉擦去。,酒精棉宜小，用大头针裹少许脱脂棉捻紧，蘸上75消毒酒精挤干,轻轻将单孢子液滴擦掉，特别要注意少量棉丝有可能把需要保留的液滴在无意中吸掉。如此将盖玻片置凹球片上，在适宜的温度和湿度下培养，每天观察，待菌丝长满培养液滴时，用灭菌小铲取一小簿片无菌的洋菜固体培养基，置于生长的单孢子菌丝体边。或用毛细管吸取稀的洋菜培养基滴于液滴边。使单孢子发育的菌丝继续生长在洋菜块上。每天观察，待长满洋菜块后，再用灭菌小铲将单孢子菌丝体移种至斜面，继续培养到长成单菌落。每批微观单孢子分离需挑3050个单个孢子，长成单菌落后进行筛选。,
